你是否也遇到过这样的困惑？
问：做流式实验时，明明脾脏样本分群清晰漂亮，可一旦换成肝脏、肺部或肿瘤组织，数据就变得“糊成一片”？
答：其实，这往往不是你的操作失误，而是忽略了不同实体组织本身的特异性挑战。
今天，我们就来化繁为简，系统梳理一套从小鼠复杂组织中圈定白细胞的完整实战策略。从优化组织消化到规避常见干扰，助您轻松应对多器官样本，稳定产出高质量、可发表级的流式细胞术数据。

圈门的四大基石

碎片去除：组织消化后会产生大量碎片。利用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号极低的特性，圈定并排除这些非细胞结构，为后续分析清扫“战场”。

死活染料：实体组织的死细胞极易非特异性结合抗体，产生强背景噪音。推荐使用菲恩生物的死活染料，即使经过固定破膜也能识别并剔除死细胞。

单细胞门：细胞粘连会导致荧光信号异常失真。通过绘制FSC-H对FSC-A散点图，沿对角线圈出主群体，能有效排除粘连体，确保分析对象的真实性。

CD45设门：作为白细胞的通用标志物，CD45能将所有免疫细胞与组织中不表达该抗原的内皮、上皮等结构性细胞分离，为后续的精细分型提供纯净起点。

标志物及应用

“净化门”是一种通过特异性标志物主动排除干扰细胞的策略，旨在为后续免疫分型提供纯净背景。

针对不同组织，需选用特定“过滤器”：

血管丰富组织（如肝、肺）：使用CD31抗体剔除内皮细胞和血小板；

间质丰富组织（如脑、肿瘤基质）：利用CD90.2识别并排除成纤维细胞等间质成分（需注意T细胞也表达）；

上皮来源组织（如肠、乳腺）：采用CD326 (EpCAM) 抗体有效分离上皮细胞。

这一策略如同淘金筛网，能显著提升数据分析的准确性与纯度。

该图展示了一套针对实体组织的流式分析标准策略，旨在从复杂悬液中区分免疫细胞与基质细胞。

首先，在FSC-A vs SSC-A图中通过R0圈定计数微球用于定量，并利用R1门排除碎片杂质。

接着进行谱系分离：在R1门内依据CD45、CD326及CD31的表达差异，将细胞划分为白细胞（R2）、上皮细胞（R3）和内皮细胞（R4），有效区分了造血细胞与结构细胞。

，对各亚群进行死活染料（FVD）分析，剔除死细胞（R5），从而获得存活的白细胞（R6）、上皮细胞（R7）及内皮细胞（R8）。

这套“去碎片-分谱系-除死细胞”的严密流程，为后续肿瘤微环境研究提供了高纯度、高可靠性的数据基础。

圈门策略

针对小鼠不同组织的免疫微环境特点，流式分析策略需进行针对性调整，以确保数据的准确性。

1. 肝脏组织：剔除内皮与区分ILCs

肝脏非免疫细胞占比极高，且固有免疫细胞为主。由于肝血窦内皮细胞可能低表达CD45，仅靠CD45圈门易将其误纳入白细胞群。

因此，必须采用“CD45+CD31-”双标设门，利用CD31排除内皮细胞，锁定真正的枯否细胞、T细胞等。

此外，为区分T细胞与固有淋巴细胞（ILCs），需联合使用CD90.2标志物。T细胞通常为CD3+CD90.2+，而ILCs为CD3-CD90.2+，这能有效避免将肝脏中丰富的ILC2亚群误判为T细胞，同时辅助排除不表达CD90.2的成纤维细胞。

2. 肺脏组织：警惕巨噬细胞的遮蔽效应

肺泡巨噬细胞在肺组织中数量庞大，且具有强自发荧光或非特异性吸附抗体的特性。

若不优先处理，它们不仅会占据大量检测通道信号，掩盖T细胞、DC等稀有亚群，还会增加背景噪音。

关键策略是先通过物理参数或特异性标志物去除肺泡巨噬细胞，降低背景干扰，使目标细胞群的信号更清晰，从而保证后续分型的准确性。

3. 肿瘤组织：层级设门规避干扰

肿瘤微环境复杂，死细胞多且异质性强。

首先，死活染料必须在CD45+群体内进行二次筛选，避免肿瘤坏死碎片干扰。

其次，为防止CD45low的肿瘤细胞混入，建议联合TCRβ/CD19/NKp46或CD11b/Ly6G等谱系抗体锁定免疫细胞。

，遵循“先大群后亚群”原则，例如先圈定CD45+CD11b+髓系细胞，再从中分析DC或MDSC，防止被优势群体（如M2巨噬细胞）掩盖稀有亚群信号。

4. 脑组织：基于CD45强度区分来源

脑组织免疫细胞含量极低（<1%），核心在于区分固有与浸润细胞。小胶质细胞通常表现为CD45low，而外周浸润白细胞为CD45high，利用这一表达强度差异可进行有效分离。在此基础上，使用CD11b进一步划分髓系与淋巴系。必要时，还可加入CD31排除血管内皮细胞，或使用CD45RA排除神经干细胞，从而在复杂的脑组织中捕获目标免疫亚群。

应对复杂组织的流式检测挑战，除了依赖优化的圈门策略，选择经过充分验证的高质量试剂与稳定的仪器平台同样是获取成功的关键基石。

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