降落PCR的程序如何设置？

降落 PCR 完整程序设置方法（分通用模板 + 参数计算 + 实操案例）

一、核心参数先确定（设置前必算）

引物平均 Tm 值（上下游取平均）

降落起始退火温度：Tm + 5～8 ℃

每循环降温幅度：常用 0.5 ℃/ 循环；杂带极多时可用 1 ℃/ 循环

降落循环数：10～15 个循环

终段固定退火温度：Tm - 0～2 ℃

终段常规扩增循环数：20～25 个循环

延伸时间：1 kb DNA ≈ 1 min

二、标准四段式程序结构

预变性（充分解开双链）

降落梯度循环段（高温逐步降温，抓特异性）

恒温扩增段（富集目的条带，保证产量）

终延伸（补齐末端 A 尾）

三、通用标准程序（可直接套用）

条件示例：引物平均 Tm=60℃，目的片段 1000 bp

预变性：95 ℃，3 min

降落阶段（12 个循环）

95 ℃ 30 s → 67 ℃（每循环减 0.5℃）30 s → 72 ℃ 1 min

12 轮结束后退火温度降到：61 ℃

恒温扩增阶段（22 个循环）

95 ℃ 30 s → 60 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min

终延伸：72 ℃，5 min

保温：4 ℃ ∞

四、不同实验场景微调方案

1）杂带很多、同源序列多（强特异性模式）

起始温度：Tm+8℃

降温幅度：0.5℃/ 循环

降落循环：15 轮

2）模板浓度低、担心扩不出来（灵敏平衡模式）

起始温度：Tm+5℃

降温幅度：1℃/ 循环

降落循环：10 轮

3）高 GC 模板（60% 以上 GC）

整体温度上调 2～3℃，可搭配 DMSO / 甜菜碱，延伸时间适当延长

4）短片段＜500 bp

延伸改为 30 s 即可

五、关键设置注意事项

不要降温过快

单次降 1℃以上、降落循环少于 8 轮，会大幅削弱特异性，失去降落 PCR 意义。

总循环数控制

降落循环 + 恒温循环不超过 40 轮，过多会放大微弱非特异产物。

搭配热启动酶效果翻倍

普通 Taq 室温会预延伸，降落 PCR 优势大打折扣，优先热启动 / 高保真酶。

若降落结束温度低于目标 Tm

恒温段温度统一拉回引物最佳 Tm，保证扩增效率。

六、极简速记设置公式

起始退火温度 = 引物平均 Tm + 6 ℃

每循环降温 0.5 ℃，降落 12 个循环

剩余 20～22 轮固定在引物 Tm 扩增