四环素类药物快速检测试剂盒使用说明书

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物四环素类药物类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争四环素类药物类药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物四环素类药物类药物的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物四环素类药物类药物的含量。

【试剂盒技术指标】

规格：96孔/盒

灵敏度：0.05ppb

检测时间：45min

样本检测下限：

组织样本（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼、鸡蛋）：

四环素………………………………………………1ppb

二甲胺四环素………………………………………1ppb

吡四环素……………………………………………1ppb

金霉素………………………………………………1ppb

脱甲基金霉素………………………………………2ppb

土霉素………………………………………………2ppb

强力霉素……………………………………………2ppb

牛奶、蜂蜜、尿液样本：

四环素………………………………………………2ppb

二甲胺四环素………………………………………2ppb

吡四环素……………………………………………2ppb

金霉素………………………………………………2ppb

脱甲基金霉素………………………………………3ppb

土霉素………………………………………………3ppb

强力霉素……………………………………………4ppb

交叉反应率：

四环素……………………………………………100%

二甲胺四环素…………………………………… 125%

吡四环素………………………………………… 110%

金霉素…………………………………………… 100%

脱甲基金霉素……………………………………85%

土霉素……………………………………………88%

强力霉素………………………………………… 49%

样本回收率：

组织……………………………………85%±20%

牛奶、蜂蜜……………………………… 80%±20%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

2、 标准品溶液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶标记物7ml………………………红色帽

5、 抗体工作液7ml………………………绿色帽

6、 底物A液 7ml………………………棕色帽

7、 底物B液 7ml ……………………黑色帽

8、 终止液7ml ……………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40 ml ………………白色帽

10、 2X浓缩复溶液50ml ·………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、刻度移液管

微量移液器：单道20μl～200μl、单道100μl～1000μl多道30～300 μl

试剂：甲醇、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl

【实验前溶液配制】

配液1、20mM PBS缓冲液

5.16g Na2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；

加入蒸馏水至1000ml；用于样品提取液的配制。

配液2、样品提取液的配制

取1ml甲醇与9ml的20mM PBS缓冲液混匀。

配液3、将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶掖+1份去离子水，用于样本提取后的复溶)。

配液4、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀

释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按 所需用量配制洗涤液

【样本前处理步骤】

u样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

u样本处理：

（a）组织样本前处理方法（鸡、鸭、猪肉/肝、虾、鱼、鸡蛋）

1、 称取1±0.05g均质后的样本于离心管中，加入4ml样品提取

液，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一试管中;加入1ml 正己烷,振荡1min，

室温4000r/min以上，离心10min；

3、 取50 µl下层液与200μl已稀释后的复溶液混合30s；

4、 取50 μl用于分析

样本稀释倍数:20倍

（b）蜂蜜处理方法（样本稀释倍数: 40 倍）

1、 准确称取1±0.05g蜂蜜样本于离心管中，加入4ml样品提取

液，强烈混合振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min

2、取出50μl上清液于另一试管中，加入450μl已稀释后的复溶液

混合30s；

3、取50 μl用于分析

（c）牛奶样品处理方法（样本稀释倍数: 40 倍）

脱脂牛奶

1、取出50μl脱脂牛奶与1950μl已稀释后的复溶液，混30s；

2、取50 μl用于分析

脂肪奶

3、吸取1ml牛奶样本于离心管中；于15℃环境3000r/min，离心

10min；（如果没有冷冻离心机请预先冷却后再离心)

4、取出50μl牛奶于与1950μl已稀释后的复溶液，混合30s；

5、取50 μl用于分析

（d）饲料（样本稀释倍数：30倍）

1、 称取3±0.05g 均质后的样本于离心管中，加入9ml甲醇，

振荡5min，室温4000r/min 以上，离心10min；

2、取3ml上层液体上层清澈有机相至干燥溶器中，56℃氮气吹干/旋转蒸发至干；

3、用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃离心5min；

4、取下层50µl+450µl稀释后的复溶液混合30s；取50µl溶液用于分析

【酶标免疫分析程序】

1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

5、 取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 显色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含四环素类药物的含量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243；0.05ppb为1.816,0.15ppb为1.415；0.45ppb为0.74；1 .35ppb为0.313；4 .05ppb为0.155。

则样本1的浓度范围是1.35ppb～4.05ppb；样本2的浓度范围是0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素类药物实际浓度。

2、定量分析：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光值

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以四环素类药物标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素类药物实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

0.05 0.15 0.45 1.35 4.05

四环素类药物(ppb)[µg/kg]

图1：四环素类药物检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

0 0.05 0.15 0.45 1.35 4.05

四环素类药物(ppb) [µg/kg]

图2：四环素类药物检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出四环素类药物检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应四环素类药物浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。