黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒使用说明书

【产品简介】

黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。薄层色谱一直是检测黄曲霉毒素常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素B1残留。参考国家标准GB/T 5009.22-2003。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉毒素B1和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素B1的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物黄曲霉毒素B1的含量。

【试剂盒技术指标】

规格：96孔/盒

灵敏度：0.025ppb

检测时间：75min

样本检测下限：

大米、玉米、小米………………………………2.5ppb

酱油、醋…………………………………………0.5ppb

食用油……………………………………………2.5ppb

酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒）…………………0.5ppb

花生……………………………………………2.5ppb

月饼、桃酥、花生酱等……………………………1ppb

面粉………………………………………………1ppb

一般饲料…………………………………………2.5ppb

饲料（配合料及浓缩料）…………………………1ppb

牛奶………………………………………………0.5ppb

反应率：

黄曲霉毒素B1……………………………………100%

回收率：

食品…………………………………………85±10%

饲料…………………………………………75±10%

【试剂盒组成】

1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、 标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb

3、 高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶）10ppb

4、 酶标记物12ml…………………………红色帽

5、 抗体工作液7ml…………………………绿色帽

6、 底物液A液7ml…………………………棕色帽

7、 底物液B液7ml…………………………黑色帽

8、 终止液7ml…………………………黄色帽

9、 20X浓缩洗涤液40ml……………………白色帽

10、 2X浓缩复溶液50 ml…………………… 蓝色帽

【所用仪器、试剂】

仪器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/

氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、

刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：单道20µl～200µl、100µl～1000µl、多道250µl

试剂：甲醇、、正己烷、滤纸

【实验前溶液配制】

配液1、50%甲醇溶液：

50ml蒸馏水或去离子水和50ml纯甲醇混合制备50％甲醇溶液。

配液2、将2×浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样品的稀释。

配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】

处理任何样本时，都必须注意：

（1）实验中须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头

（2）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

一、食品

（a）脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)

1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min。

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与稀释后的复溶液450ul充分混合30s

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:100

(b)酱油、醋

1、称取2g样品于50ml离心管中；先加入3ml去离子水充分混匀，再加入10ml，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

2、取出下层5ml的到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

4、取50ul与稀释后的复溶液950ul充分混合30s，

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:20

(c)食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等)

1、称取1g油样品于10ml离心管中，先加入2ml正己烷，再加入5ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取下层溶液50ul与稀释后的复溶液200ul充分混合30s

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:25

(d)酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒）

1、称取2g酒样品于50ml离心管中；加入10ml，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

2、取出下层5ml的到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

4、取50ul与稀释后的复溶液950ul充分混合30s，

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:20

(b)花生

1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，先加入5ml正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取下层溶液50ul与稀释后的复溶液450ul充分混合30s

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:100

(e)月饼、桃酥、花生酱等

1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中，先加入5ml正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取下层5mL提取液于50ml离心管中；加入10ml，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。

3、取出下层5ml的到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

4、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

5、取50ul与稀释后的复溶液950ul充分混合30s，

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:40倍

(f)面粉

1、称取2g面粉样品于50ml离心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取过滤溶液5mL于50ml离心管中；加入10ml，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。

4、取出下层5ml的到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

6、取50ul与稀释后的复溶液950ul充分混合30s，

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:40倍

二、饲料

(a)一般饲料及原料（脂肪和蛋白含量小的饲料)

1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5分钟。

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与稀释后的复溶液450ul充分混合30s

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:100

(b)配合料及浓缩料（脂肪和蛋白含量高的饲料)

1、称取2g样品于50ml离心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取过滤溶液5mL于50ml离心管中；加入10ml，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。

4、取出下层5ml的到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。

6、取50ul与稀释后的复溶液950ul充分混合30s，

取50ul进行分析。

样本稀释倍数:40倍

三、动物制品（组织、血清、奶制品）

(a)血清、生鲜牛奶；

1、直接取50µl牛奶+950µl稀释后的复溶液混合30s；

2、取50µl用于检测检测分析。

样本稀释倍数:20

(b)动物组织、奶粉、奶油、奶酪

1、称取2g样品于50ml离心管中，加入4ml甲醇，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，

4、取50ul下层溶液进行检测分析。

样本稀释倍数:1

【备注】

如根据样品的国家允许量标准判定（详见附件表），在样品测定前，用稀释后的复溶液将样品提取液再进一步进行适当倍数稀释，即为待测样品液；取50ul待测样品液进行定量或限量测定。

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、 显色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与黄曲霉毒素B1的含量成负相关

1、粗略判定：

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含M1浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.248，样品2的吸光度值为1.021，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.821；0.025ppb为1.434；0.075ppb为1.163；0.225ppb为0.767；0.675ppb为0.298；2.025ppb为0.106。则样品1的浓度范围0.675ppb-2.025ppb；样品2的浓度范围0.075ppb-0.0.225ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准准曲线：

B/B0 (%)

0.025 0.075 0.2250.6752.025

黄曲霉毒素B1(ppb)[µg/kg]

图1：黄曲霉毒素B1检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

00.025 0.075 0.225 0.6752.025

黄曲霉毒素B1 (ppb)[µg/kg]

图2：黄曲霉毒素B1检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出黄曲霉毒素B1检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉毒素B1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

【备注】

如根据样品的国家允许量标准判定（详见附件表）；在样品测定前，用样品稀释液将样品提取液再进一步进行适当倍数稀释，即为待测样品液；取50ul待测样品液进行定量或限量测定。

附件表：黄曲霉毒素B1国家允许量标准

（说明：色拉油卫生标准GB13103-91和精练食用植物油卫生标准GB15197被GB2716－2005覆盖取代。）