自然杀伤细胞（NK细胞）是固有免疫系统中重要的效应细胞，在抗病毒和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。为开展相关研究与应用，常需从外周血单个核细胞中通过密度梯度离心结合免疫磁珠分选技术分离高纯度NK细胞，并利用IL-2或IL-15进行体外扩增培养，以维持其活性与功能。培养后的细胞可通过流式细胞术进行鉴定，典型表型为CD3⁻CD56⁺，结合其他表面标志物分析可评估其纯度、亚群及活化状态。该技术体系为NK细胞的基础研究及临床转化提供了重要支撑。

一、NK细胞培养

1.材料与仪器

实验涉及NK细胞及NKT细胞的分离与培养，使用rhIL-2、rhIL-18和rhIL-21等细胞因子进行刺激扩增，并采用PRIME-XV NK Cell CDM无血清培养基优化生长条件。主要设备与耗材包括二氧化碳培养箱、离心机、细胞计数仪、磁珠分选系统、流式细胞仪，以及移液器、移液管和离心管等常规实验器材，确保细胞操作的准确性与可重复性。

2.步骤

制备NK细胞培养基：将PRIME-XV NK Cell CDM分别配制为含500 IU/mL rhIL-2、10 ng/mL rhIL-12、rhIL-18和rhIL-21的1x接种培养基，以及浓度翻倍的2x扩增培养基。使用前将培养基预热至37℃。冻存或新鲜细胞均用含10 mL预热培养基的15 mL离心管解冻或转移，300 g离心5分钟，弃上清后重悬。若使用PBMC，需通过磁珠或流式分选富集NK细胞，可采用CD56阳性或CD3阴性分选法。分选后进行细胞计数，并通过流式细胞术检测细胞活力及CD3⁻CD56⁺表型，评估富集效果。

3.NK细胞培养设置

将富集后的NK细胞以0.5×10⁶ cells/mL的密度重悬于含细胞因子的1x接种培养基中，并加入活化磁珠（如市售产品）进行刺激。将2 mL细胞悬液接种于T-25培养瓶中，在37℃、5% CO₂及加湿条件下培养，最长可达14天。每2–3天补充等体积的2x扩增培养基以维持因子浓度，必要时转移至更大容器以增加培养体积。期间无需离心，但需定期检测细胞密度、活率及CD3⁻CD56⁺表型，以监控扩增效果与细胞状态。

4.NKT 细胞的准备

使用前将PRIME-XV NK Cell CDM预热至37℃至少15分钟，避免反复冷热交替。冻存或新鲜细胞均转移至含10 mL预热培养基的15 mL离心管中，300 g离心5分钟，弃上清后保留少量液体重悬细胞沉淀。如使用PBMC，可选磁珠或流式分选法富集NKT细胞，并进行细胞计数与表型分析。

5.NKT细胞培养设置

将NKT细胞重悬于含1000 IU/mL IL-2的PRIME-XV NK Cell CDM中，调整密度为0.5×10⁶ cells/mL，以2 mL/瓶接种于T-25培养瓶，于37℃、5% CO₂加湿培养箱中垂直培养，最长14天。每2–3天补充2x扩增培养基使体积加倍，必要时换用更大容器。期间无需离心，但需定期检测细胞密度、活率及表型，监控扩增状态。

二、流式细胞术分析

制备单细胞悬液（如全血、PBMC或组织样本），调整细胞密度至2×10⁵/管。若使用可固定死活染料，直接染色后洗涤；否则在表面染色后加入核酸死活染料。先做Fc阻断，再加入CD45、CD3、CD56、CD16等表面抗体，4℃避光孵育20分钟。如需检测胞内指标，经固定破膜后加入胞内抗体，冰上避光孵育40–60分钟，洗涤重悬于DPBS。全程避免光照，保持样本4℃，及时上机检测。实验前需设置空白、单染及全染对照管以确保结果准确性。

三、质谱流式

相比流式细胞仪，质谱流式细胞仪（CyTOF）利用重金属同位素标记抗体，可在单细胞水平实现多达40种以上参数的检测。其原理是通过检测不同质量数的稀土金属信号，准确识别细胞表型，如NK细胞亚群。由于金属信号无重叠，无需荧光补偿，提高了数据准确性。该技术避免了光谱干扰，极大拓展了多色分析能力，为高维免疫分型提供了强大工具。

NK细胞可通过密度梯度离心联合磁珠分选从外周血中分离，经IL-2等细胞因子体外扩增培养。培养后利用流式细胞术进行鉴定，以CD3⁻CD56⁺为典型表型，结合CD16等标志物分析纯度与亚群。该方法支持NK细胞功能研究及临床应用，是免疫学研究的重要技术手段。菲恩生物专注于NK细胞研究，提供高品质的分离试剂、培养支持及流式检测试剂。我们可推荐优化的多色抗体组合与配色方案，准确鉴定CD3⁻CD56⁺等表型，助力NK细胞分离、扩增与功能分析全流程，为免疫学研究提供可靠技术支持，欢迎咨询合作。

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