真菌/酵母细胞线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途

真菌/酵母细胞线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂是一种旨在通过特异性染色剂分析线粒体膜心磷脂的变化来定性或定量测定线粒体内含质量以及自由基、氧化物等对细胞线粒体的毒性与损伤作用的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种实验用真菌/酵母菌株线粒体的损伤/氧化的检测分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

真菌/酵母细胞是一种低等单细胞真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单明了等原核生物的特点。作为模式生物，它具有比较完备的基因表达调控机制和表达产物的加工修饰能力，在分子遗传学方面认识最早，zui先作为外源基因表达的细胞宿主。线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。在光学显微镜下线粒体呈现为颗粒状、棒状或弯曲细线。心磷脂（Cardiolipin）是线粒体膜上的主要成分之一。它对细胞氧化特别敏感。线粒体脂类分解，致使心磷脂显著减少，最终造成线粒体的严重损害。Nonyl-Acrydine Orange（NAO）是一种可自由通过细胞膜的染色剂，特异性地染色线粒体上的心磷脂，并发出荧光。一旦线粒体膜质量减少或受到损害以及被氧化，其荧光显著减弱。

产品内容

清理液（Reagent A）毫升

染色液（Reagent B）微升

稀释液（Reagent C）毫升

固着液（Reagent D）毫升

产品说明书1份

保存方式

保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效bao证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于真菌/酵母染色的容器

载玻片：用于染色观察

微型台式离心机：用于沉淀真菌/酵母细胞

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析

荧光分光光度仪：用于细胞荧光定量分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，将染色工作液置入暗室里。同时开启荧光显微镜或荧光光度仪。然后进行下列操作。

一、 活体染色

1． 准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷细胞/毫升）

2． 移入到1.5毫升离心管

3． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心抽掉上清液

5． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

6． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

7． 小心抽掉上清液

8． 重复实验步骤5至7一次

9． 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混匀（注意：参见注意事项6）

10． 放进20℃培养箱里孵育20分钟

11． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心抽掉上清液

13． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

14． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心抽掉上清液

16． 加入xx微升预冷的清理液（Reagent A），混匀

17． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察（定性检测）：

1） 移出5微升在载玻片上，放上盖玻片

2） 即刻进行载玻片压片（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm

红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

（B）激发波长495nm，散发波长519nm

绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

18． 或使用荧光分光光度仪

1） 移取500微升染色后的细胞样品到用户自备的1毫升比色皿

2） 加入xx微升清理液（Reagent A）

3） 上下倾倒混匀

4） 即刻放进荧光分光光度仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低

二、 固定染色

1． 准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷细胞/毫升）

2． 加入到1.5毫升离心管

3． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心抽掉上清液

5． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

6． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

7． 小心抽掉上清液

8． 重复实验步骤5至7一次

9． 加入xx毫升－20℃预冷的固着液（Reagent D），混匀

10． 放进－20℃冰箱里孵育20分钟

11． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

12． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心抽掉上清液

14． 重复实验步骤11至13二次

15． （选择步骤）置于100瓦超声仪下，功率20％，猝击5秒一次（分离集聚一起的细胞）

16． 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混匀（注意：参见注意事项6）

17． 放进20℃培养箱里孵育20分钟

18． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

19． 小心抽掉上清液

20． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

21． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

22． 小心抽掉上清液

23． 加入xx微升预冷的清理液（Reagent A），混匀

24． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察（定性检测）：

1） 移出5,微升在载玻片上，放上盖玻片

2） 即刻进行载玻片压片（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm

红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

（B）激发波长495nm，散发波长519nm

绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

25． 或使用荧光分光光度仪

1） 移取500微升染色后的细胞样品到用户自备的1毫升比色皿

2） 加入xx微升清理液（Reagent A）

3） 上下倾倒混匀

4） 即刻放进荧光分光光度仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 染色剂可以自由进入细胞

4． 孵育时，必须避免光照

5． 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析

6． 剩余的染色工作液可放进－20℃储存备用

7． 本产品适合活体染色和固定染色，染色剂不易洗掉，染色持久

8． 根据不同菌株类型，可以调整染色工作液的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色

9． 用户可以调整体系用量，增加检测次数

10． 红光检测具有特异性，而绿光检测线粒体质量变化

11． 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息

单组分订购信息

编号名称规格

G&VS10017.3真菌/酵母细胞线粒体损伤/氧化荧光测定试剂盒20次

G&VS10017.3A清理液（Reagent A）毫升

G&VS10017.3B 染色液（Reagent B）微升

G&VS10017.3C稀释液（Reagent C）毫升

G&VS10017.3D 固着液（Reagent D）毫升

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