引言

基于细胞活性和毒性检测的实验在基础研究中有广泛的应用，类似的实验也用于临床前研究，以表征化合物诱导的细胞毒性和副作用。相对于生物化学的方法，细胞实验能够提供更多的生理相关数据，如细胞增殖，形态和信号通路等。

ATPlite 1step 化学发光实验使用代谢活性细胞中的 ATP 作为细胞活力的标志物。利用细胞凋亡和坏死时 ATP 浓度降低这一方法监测化合物诱导的细胞毒性作用是非常快速和灵敏的方法。

新面市的 VICTOR Nivo™ 多功能酶标仪其整合了光吸收，化学发光，荧光强度，时间分辨荧光以及荧光偏正五种检测模式。VICTOR Nivo™ 读板器提供基于微孔板顶部和底部的检测，底部检测模式允许盖板盖，并在细胞相关的实验测定中实现更好的灵敏度。

材料和方法

在含有 10％ 胎牛血清 (FCS)，1％ 青霉素(100U / mL) /链霉素 (100μg/ mL) 的 Dulbecco's Modified Eagle 培养基 (DMEM) 中培养人肝细胞癌细胞 (HepG2，DSMZ no. ACC180) 2mM 谷氨酰胺。 将中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1，DSMZ no.ACC 110) 放置在含 10％ FCS 和1％ 青霉素 (100U / mL) /链霉素 (100μg/ mL) 的 DMEM / F-12 培养基中培养。

ATPlite 1step 检测方法：先将细胞润洗，胰蛋白酶消化后重悬于细胞培养基中并转移至 384 孔板（每孔 25μl 细胞悬液）或 96 孔板（每孔 100μl 细胞悬液）。（推荐使用 PerkinElmer 白色细胞培养板 CulturPlate-384，＃6007680或 CulturPlate-96，＃6005680）

24h 后，用 DMSO (终浓度为 0.5％v / v) 溶解化合物 (秋水仙碱，5-氟嘌呤，Pac1) 并使用 Echo 液体处理系统 550 (Labcyte，Inc)加样。在37℃，5％ CO2 条件下孵育 48 小时。将冻干的荧光素酶底物溶于 ATPlite 1step 缓冲液中，并在细胞中加入底物 (25μl/ 384 孔板，96 孔板/100μl )。根据试剂盒说明书，在加入前将 ATPlite 试剂平衡至室温。最后放入 VICTOR Nivo™ 酶标仪读数。测试步骤中需要预先将额外的 60s 振荡步骤添加到发光检测步骤 (ATPlite Luminescence) 中。最后使用 GraphPad Prism 软件进行数据分析。

结果

为了展示 VICTOR Nivo™ 酶标仪和 ATPlite 1step 方法对化合物的细胞毒性检测，我们研究了其方法的稳定性，灵敏度和动态范围。

图 1 ATP 的标准曲线滴定检测该方法的线性和动态范围。

图 2 384 孔板中，细胞数目和检测信号的相关性。

图 3 96 孔板中，细胞数目和检测信号的相关性。

图 4 CHO-K1 细胞上的 DMSO 耐受结果。

图 5 使用 CHO-K1 细胞，对秋水仙碱（A） ，5-氟尿嘧啶核苷（B），6-巯基嘌呤（C）的细胞毒性实验评估。

图 6 采用 Z’ 表针该实验的稳定性

表 1 使用 CHO-K1 细胞，采用 ATPlite 1step luminescence assay 测试得到的 CV 和 z’。分别采用秋水仙素和 DMSO 做为阳性和阴性对照。

结论

该研究展现了应用 ATPlite 1step luminescence assay 以及 VICTOR NIVO™ 多模式酶标仪检测细胞毒性的成功案例。VICTOR NIVO™ 一体化的安装化学发光检测模式适用于对应的检测方法并可灵活调整。

ATPlite 1step luminescence assay 简易性和稳定性的优势有利于对应的细胞系的条件优化，动态范围和线性条件符合方法开发的要求。高数值的 z’ 和低数值的误差数据展现了该方法测试大量化合物的适用性。