细胞凋亡（Apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，普遍存在于生物界，对机体的防御和免疫反应等起着重要作用，并具有潜在的治疗意义。

细胞凋亡经历早期、中期和晚期。凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（PS）外翻到细胞膜表面，可用Annexin V细胞凋亡试剂盒检测；凋亡晚期，DNA碎裂，可用TUNEL细胞凋亡试剂盒检测。

一、TUNEL试剂盒实验原理

TUNEL全称是TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，译成中文—脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法。

细胞凋亡时，染色体DNA断裂会产生大量的粘性3＇-OH末端，而这些暴露的3＇-OH能够在TdT的催化下连接上荧光素标记的dUTP，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，从而准确地反映出细胞凋亡特征。

TUNEL适用的样本类型很多样，既可以是细胞样本(细胞涂片、细胞爬片、悬浮细胞)，也可以是组织样本(石蜡切片、冰冻切片)，因而在细胞凋亡研究中被广泛应用。

二、TUNEL实验常见问题分析

1.荧光信号弱或无信号

1）先是样本处理不当导致

a.样本切片存放时间过久，导致染色标记效率降低，需要使用新鲜的切片。

b.样本切片太厚，可以适当切薄，便于标记染色。

c.脱蜡/水化不充分，需要充分脱蜡。

d.蛋白酶K孵育时间过短，需要优化孵育时间。

e.样本没发生晚期凋亡。

2）其次是标记染色的问题

a.严格避免干片，样本切片在加上TUNEL标记工作液后，在湿盒中进行避光孵育。

b.标记染色时间过短，正确的染色方法一般为37℃避光孵育60min。

3）也可能是由TdT酶失活造成的，TUNEL标记工作液应现配现用，不宜长时间保存。

2.非特异性染色，高假阳性

造成这个问题同样可以从样本处理和标记染色两个方面分析：

1）样本处理

a.固定液浓度过高或者作用时间太久导致 DNA链不规则断裂。

b.蛋白酶K处理时间过长，也会破坏核酸结构，出现假阳性。

c.有些样本中(例如平滑肌细胞或组织)，DNA酶或DNA聚合酶的活性水平较高，易发生非特异性的荧光标记，因此取得这些细胞或组织后需立即充分固定。

2）标记染色

a.标记检测过程中保湿工作不到位，造成样本干燥，可能会出现非特异性荧光。

b.标记染色时间过长也会导致假阳性发生，一般37℃避光孵育60min即可；

c.标记染色后，样本未充分清洗也是造成非特异性荧光出现的重要原因。

3.背景荧光高

造成这个问题可以从样本处理和标记染色和荧光拍照这3个方面分析：

1）样本处理

a.支原体污染会导致荧光染色背景过强，可用支原体检测试剂盒对细胞样本进行检测。

b.样本中如果存在红细胞，其血红蛋白会产生严重自发荧光，从而造成荧光背景过强，可选择其它适合该样本的细胞凋亡检测试剂盒。

2）标记染色

a.标记染色时间过长。

b.标记染色后，未充分清洗样本，可增加漂洗次数，避免切片样本残留染料。

3）荧光拍照

拍照时，曝光时间过长也会导致荧光背景过强，需调整曝光条件，可先将阴性样本组调整到无背景荧光，再用此曝光条件拍摄实验组。

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