天津本生—PCR技术原理、实验步骤和应用

、实验目的

　　1.掌握聚合酶链式反应的原理。

　　2.掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

　　二、实验原理

PCR技术，即聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年获诺贝尔化学奖)建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析zui常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

　　PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

　PCR由变性－－退火－－延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备;

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸：DNA模板－－引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

　　重复循环变性－－退火－－延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　三、实验试剂与器材

　　模板DNA、2.5mmol/LdNTP

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O

　　PCR仪、移液枪、PCR板

　　四、实验步骤

　　1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA2μL

　　引物11μL

　　引物21μL

　　dNTP1.5μL

　　MgCl22μL

　　10×buffer2μL

　　ddH2O10μL

　　Taq酶0.5μL

　　2、设置PCR反应程序。

　　3、上样，启动反应程序。

　　4、扩增产物的电泳检测。

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