BrdU与EdU方法比较：BrdU与EdU方法比较：t-family: 隶书;">
目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法： 一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。例如：Ki67细胞增殖检测；BrdU细胞增殖检测；EdU细胞增殖检测。
另一种是间接的方法，即细胞活力检测方法，通过检测样品中健康细胞数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测方法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。例如：MTT法、CCK8试剂盒法。
MTT比色法：
是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
CCK8试剂盒法：
CCK-8试剂盒是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。
Ki67细胞增殖检测：
Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期 S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。
Brdu细胞增殖检测：
Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
但由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测，因此BrdU检测需采用DNA酶或HCl或加热使DNA变性。对于植物细胞等有细胞壁的分析，采用抗体检测还需要消化细胞壁，细胞壁消化酶常含有一些杂质，会导致检测的可靠性降低，同时BrdU检测则需要进行长时间的孵育－－几个小时甚至过夜。
BrdU与EdU方法比较：
EdU细胞增殖检测：
EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。
EdU实验步骤：
（1）实验准备：1×细胞PBS（PH 7.4），渗透剂（含0.5%TritonX-100的PBS），甘氨酸溶液（2mg/mL），细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）。
（2）细胞培养：取对数生长细胞，以每孔4×103~4×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段；
（3）转染或加药培养；
（4）EdU标记：（此步务必在超净台内完成）
a.用细胞培养基按1000 : 1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50 μM EdU培养基；
b.每孔加入100 μL 50 μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；
c.PBS清洗细胞1-2次，每次5 min，清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱。
（5）细胞固定化：
a.每孔加入50 μL细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室温孵育30 min，弃固定液；
b.每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5 min后，弃甘氨酸溶液，目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系；（注：甘氨酸溶液需去离子水配置，现用现配）
c.每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5 min，弃PBS；
d.每孔加入100 μL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育10 min，PBS清洗一次，5 min。
（6）Apollo染色：
a.每孔加入100 μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30 min，弃染色反应液，Apollo®染色液配制参考表2-13；（注：现用现配，按顺序加试剂，30min内用完，以免影响反应体系；试剂E是粉末，容易氧化，操作时需注意，如果氧化成黄色，说明可能失效）
b.加入100 μL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床清洗2-3次，每次10 min，弃渗透剂；
c.由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景，（加强）每孔每次加入100 μL 甲醇清洗1~2次，每次5 min，PBS清洗1次，每次5 min。
（7）DNA染色：
a.用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量的1×Hoechst33342反应液，避光保存；
b.每孔每次加入100 μL 1×Hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30 min后，弃染色反应液；
c. 每孔每次加入100 μL PBS清洗1-3次，每孔加入100 μL PBS保存待用。
（8）图像获取及分析：用激光共聚焦显微镜观察并照相，注意避光操作。（注：4℃湿润保存，但最多不超过3天。）
版权声明