产品及特点细小病毒 B19(Parvovirus B19)引起的典型疾病是传染性红斑和急性关节病，在妊娠妇女可引起胎儿水肿乃至死胎。荧光定量PCR 是检测传染性疾病的 主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测细小病毒 B19 的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2.特异性高，引物是根据细小病毒 B19 高度保守区设计,不会扩增其他病毒。
3.引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4.提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。
5.一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。
6.本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
规格及成分成分编号十孔盒包装
2×qPCR MagicMix90408500 μL（棕色管）
荧光 PCR 专用模板稀释液1807011 mL（黄盖）
细小病毒 B19 染料法 qPCR
引物混合液14-30900yw100 μL（白盖）
细小病毒 B19 染料法 qPCR
阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)60908-30900pc50 μL（黄盖）
天净沙核酸释放剂（试用装）6120220 次（1mL，绿盖）
使用手册14-30900sc1 份
运输及保存低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂样品 DNA。
使用方法一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。
3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所
得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品DNA 的制备7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。8. 如果有N 个样品，则需要进行N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20 次免DNA 提取的天净沙核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了DNA 提取步骤。其使用手册请咨询客服。三、设置qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）9. 如果进行定量分析，则标记N+9 个PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6 个标准曲线样品只选一个做（可以选4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。10. 在标记管中按下表加入各成分：
6.
成分 | N+2 个 样品管 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
细小病毒B19 染料法qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 个待测样品 DNA 模板 | 6 μL | - | - |
自备超纯水 | - | 6 μL | - |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） | - | - | 各6μL（2号样到 2号管，3号样到3号管…） |
注:仅ABI7500、7700 和7900
仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和LightCycler480） 不需要使用ROX，则用水替代。11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。四、荧光定量PCR 反应参数过程温度时间
| 预变性 | 95℃ | 10 min | |
| PCR 反应 （40 个循环） | 95℃ | 15 sec | |
| | 60℃ | 1 min（采集 SYBR 通道的荧 光信号） | |
| 按仪器预设程序进行熔解曲线分析 | |
五、数据处理 12. 设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。 13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。 14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。 |
细小病毒 B19 可视化 LAMP 检测试剂盒 |
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