细小病毒 B19 染料法荧光定量PCR 试剂盒_产品说明_技术文章

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技术文章

细小病毒 B19 染料法荧光定量PCR 试剂盒

点击次数：3543 发布时间：2019/10/30 11:18:11

产品及特点细小病毒 B19(Parvovirus B19)引起的典型疾病是传染性红斑和急性关节病，在妊娠妇女可引起胎儿水肿乃至死胎。荧光定量PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测细小病毒 B19 的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2.特异性高，引物是根据细小病毒 B19 高度保守区设计,不会扩增其他病毒。

3.引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。

4.提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

5.一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6.本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。

规格及成分成分编号十孔盒包装

2×qPCR MagicMix90408500 μL（棕色管）

荧光 PCR 专用模板稀释液1807011 mL（黄盖）

细小病毒 B19 染料法 qPCR

引物混合液14-30900yw100 μL（白盖）

细小病毒 B19 染料法 qPCR

阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)60908-30900pc50 μL（黄盖）

天净沙核酸释放剂（试用装）6120220 次（1mL，绿盖）

使用手册14-30900sc1 份

运输及保存低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂样品 DNA。

使用方法一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能

污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所

得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品DNA 的制备7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。8. 如果有N 个样品，则需要进行N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20 次免DNA 提取的天净沙核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了DNA 提取步骤。其使用手册请咨询客服。三、设置qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）9. 如果进行定量分析，则标记N+9 个PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6 个标准曲线样品只选一个做（可以选4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。10. 在标记管中按下表加入各成分：

成分	N+2 个样品管	PCR 阴性对照管	标准曲线样品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
细小病毒B19 染料法qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板	6 μL	-	-
自备超纯水	-	6 μL	-
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	-	-	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3号管…）

注:仅ABI7500、7700 和7900 仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。四、荧光定量PCR 反应参数过程温度时间

	预变性	95℃	10 min
	PCR 反应（40 个循环）	95℃	15 sec
		60℃	1 min（采集 SYBR 通道的荧光信号）
	按仪器预设程序进行熔解曲线分析
五、数据处理 12. 设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。 13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。 14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
细小病毒 B19 可视化 LAMP 检测试剂盒

原创作者：上海雅吉生物科技有限公司

细小病毒 B19

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