产品及特点 滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是近几年发展起来的一种核酸恒
温扩增方法。以环状 DNA 为模板，通过一个短的 DNA 引物（与部分环状模板互补），在
phi29 DNA 聚合酶催化下将 dNTPs 转变成单链DNA，此单链 DNA 包含成百上千个
重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增 DNA 和 RNA，还可以实现对靶核酸的
信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜
力。因其高灵敏度、高特异性和可操作性，RCA 技术在基础研究、实际检测、医疗诊断及
纳米材料等方面都有很好的应用，结合细胞原位检测、单核苷酸多态性 SNPs， 蛋白质分
析、免疫芯片和全基因组的扩增等研究都能发挥其巨大的优势。
本试剂盒配备的 phi29 DNA 聚合酶具有链置换和连续合成特性，可连续合成长达 70kb
的 DNA 片段。另外，该酶具有 3’→5’外切酶校读功能，合成的 DNA 片段保真性高。
试剂盒配备的 Random Hexamers为6 碱基随机引物可对目标分子进行指数放大（通
常放大 10000 倍）。
RCA 的原理图如下：
本产品具有下列特点：
即开即用，十分简单方便，用户不需要单独准备各成分。
配方经过精心优化，最长模板可以达 70kb。
高保真酶，所得 DNA 突变率低。
本试剂盒可以进行 50 次 20uL 体系的 RCA 实验。规格及成分 成 份 编 号 十孔盒包装
变性液 100941c 125 uL
RCA 溶液 A 100941a 125 uL
RCA 溶液 B 100941b 500 uL
phi 29 DNA 聚合酶（10U/uL） 100941d 50 uL
使用手册 100941sc 1 份
运输及保存 低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。
自备试剂 模板 DNA
使用方法 1. 纯化带有靶片段的环状 DNA 或长度在 10kb 以上的线状 DNA，将其准确定量并稀
释到 2pg/uL。注意：碱变性法提取的质粒 DNA 都有残留的 RNA 污染，尽管电泳
时看不见，但测 OD 时这些 RNA 会使得 DNA 浓度虚高。因此质粒 DNA 需要电泳
时跟浓度已知的 DNA marker 比较来确定浓度。此方法误差在 2 倍之内，但可以
接受。
2. 在 PCR 塑料管中加入不超过 5 uL 纯化好的模板 DNA，用量在 50pg 左右。如果体
积不足 5uL，则用自备的超纯水补齐。最好同时做一个不加模板 DNA 模板的阴性对
照。
3. 加入等体积（2.5uL）变性液，轻柔吹打混匀。
4. 室温放置 2分钟。
5. 加入2.5uL RCA 溶液A。此时样品总体积为 10uL。
6. 在10uL 样品中，加入 10 uL 的RCA 溶液B，轻柔吹打混合均匀。
7. 加入 1 uL phi 29 DNA 聚合酶（10U/uL），轻柔吹打混合均匀。
8. 30℃保温 24 小时。注意：反应时间不要短于 24 小时。最好使用 PCR 仪进行 30℃
保温并打开热盖保温。如果采用 30℃水浴，最好在样品管中加入 30-50uL 石蜡油
以防水分蒸发，因为 30℃长时间的水浴也能使水分蒸发到管壁，从而改变反应体系
中各成分的浓度、降低 RCA 反应效率。
9. 65℃保温 10 分钟使 phi29DNA聚合酶灭活。注：由于phi29DNA 聚合酶有 DNA
外切活性，所以最好将其灭活以免干扰后续反应。
10. 立即取 5uL RCA 反应液进行电泳检测扩增效果，DNA 片段大小将在 10kb 以上，
最长可达 70kb。
11. 扩增的 DNA 可以用于后续试验或电泳检测。20190522 对虾、
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