实验材料 昆虫

试剂、试剂盒 胎牛血清 台盼蓝 乙醇

仪器、耗材 培养瓶 培养箱

细胞计数器 搅拌台 转子 离心机

实验步骤

1. 将4 ml 含10%胎牛血清的wan全昆虫细胞培养基加入一个25 cm2 培养瓶。取出一支冻存Sf9细胞的安瓿，迅速置于37℃水浴，用手后剧烈摇动融化之，当安瓿的内容物几乎wan全融化时，将安瓿浸入70%乙醇，消毒外壁。

2. 打碎安瓿颈部，将内容物转移至25 cm2 培养瓶，用手轻轻摇动培养瓶，使细胞分散均匀，于27℃温育2~3 h 直到细胞贴壁。

3. 除去旧培养液，换5 ml 含10%胎牛血清的新鲜wan全培养液。继续温育，每3天换液一次，直到细胞生长汇片。

4. 准备一个新的25 cm2 培养瓶，加入4 ml 含10%胎牛血清的wan全培养液

5. 当Sf9细胞已生长汇片时，弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的wan全培养液，用移液管轻柔吹打或用手掌轻拍培养瓶，重悬细胞。

6. 用为培养组织细胞所设计的血细胞计数器计数细胞，在25 cm2 培养瓶中接种1×106~2×106个细胞，摇动培养瓶使细胞均匀分布。于27℃温育，每3天用含10%FBS的wan全培养基换液，直到培养瓶中的细胞生长汇片。

7. 弃去汇片的单层培养细胞中的培养液，并重悬细胞。

8. 用血细胞计数器计数细胞。以约4×105~5×105细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中。于27℃温育，以60~80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔，以保/证充足的空气。

9. 每隔2~3天进行细胞计数，当细胞密度达到2×106~2×106细胞/ml 时进行传代， 将适量细胞移至一个含有新鲜wan全培养液的新培养瓶中，使终密度达到4×105~5×105细胞/ml。或者，倒出适当体枳的细胞悬液，代之以新鲜培养液。

10. 加入0.1 ml 的0.4%台盼蓝于1 ml 对数生长的细胞中，确定细胞活力。在低倍显微镜下检査细胞，计数被台盼蓝染色的细胞（死细胞），并计算总细胞数。

11. 将细胞传代至1份wan全培养液/10%胎牛血请清和1份无血清培养液混合的液体中。让细胞长至汇片（单层培养），或达到2×106~3×106细胞/ml 的密度（悬浮培养）。

12. 将细胞传代至含胎牛血清wan全培养液与无血清培养液比例为1：4的混合液中，让细胞生长。

13. 用wan全培养液与无血清培养液比例为1：8至1：10的混合液，重复细胞传代与细胞生长的步骤。

14. 用无血清培养液传代细胞。

15. 计数呈指数生长的待冻存细胞，于室温以1 000g 离心10 min，弃去上清液。

16. 用含10%胎牛血清的wan全培养液以1×107~2×107细胞/ml 的密度重悬细胞团块。 加入等体积含10%胎牛血清和20%DMSO的wan全培养液，将细胞置于冰浴。吸出 1 ml 细胞移入带螺口盖的冻存管中，于-20℃保存2 h，然后于-70℃过夜。

17. 将冻结的细胞移至液氮罐中以便长/期保存。