实验原理：

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

实验材料与仪器：

1、需要进行传代培养的细胞

2、0.25％ 胰蛋白酶工作液；RPMI 1640培养基（含10％ 小牛血清）

3、倒置显微镜，CO2细胞培养箱、吸管、培养瓶/皿、 超净工作台、封口膜、酒精

实验步骤

贴壁细胞：

1、材料选取与漂洗

选取生长密度80%左右即处于生长对数期的HeLa细胞，在超净工作台中操作，吸去培养皿中的旧培养基，加入1-2 mL的PBS溶液，轻轻润洗，漂洗细胞以除去残留的血清。

2、胰蛋白酶消化

向培养皿中加入足以覆盖细胞层的0.25%胰蛋白酶消化液（约1-2 mL）。将培养皿置于37℃、5% CO₂培养箱中孵育2-3分钟（消化不够，可适当延长时间）。倒置显微镜下实时观察，大部分细胞形态变圆切边缘透亮时，加入等体积含10%血清的完全培养基以终止消化反应。

3、细胞悬液制备与离心

用移液枪轻柔吹打细胞使其成为细胞悬液。将细胞悬液转移到1.5ml离心管中，室温，1000 rpm，离心5分钟。

4、重悬与分盘

离心后，用吸引器轻轻吸去上清，加入1ml完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代（不同细胞特性不同，分盘比例适当调整），将1皿细胞的细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

5、标记与培养

接种好后，在新的培养器皿上标记好细胞名称、传代代数、操作日期及操作者姓名。轻轻摇匀后转移至37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。

6、观察

培养24小时后，依据培养基pH指示剂颜色变化（如酚红）及细胞生长密度，决定后续操作：更换新鲜培养基、继续进行传代或执行细胞冻存。

悬浮细胞或半贴壁细胞
1、制备细胞悬液
取状态良好的细胞，在生物安全柜中操作，用移液管把细胞轻柔吹打均匀。
2、离心
把细胞悬液转移到15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。
3、重悬
轻轻吸去上清后用完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。
4、标记与培养
接种好后，在新的培养器皿上标记好细胞名称、传代代数、操作日期及操作者姓名。轻轻摇匀后转移至37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。
5、观察
细胞培养24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行后续相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理或者进行冻存处理）。