miRNA是大有希望的生物标志物，但精确检测和定量并不是一件易事。为此，捷克的研究人员近日评估了三种miRNA检测技术，比较了它们的定量偏倚、一致性和稳健性。他们在本期《BioTechniques》杂志上发表了分析结果。

目前，研究人员已经开发出多种方法来检测miRNA，包括RNA测序、芯片和RT-qPCR。测序法和芯片法的优势分别在于发现新颖的miRNA，或寻找与疾病相关的差异表达miRNA，适合高通量的miRNA分析，但不适合常规使用。对诊断领域而言，最具潜力的方法仍是金标准的RT-qPCR。



RT-qPCR方法大家都很熟悉，通常是先将成熟的miRNA转化成cDNA序列，然后利用qPCR进行扩增。这种技术可以在标准的设备上自动化开展，因此如今已被广泛使用。qPCR方法的灵敏度、特异性和重复性都是非常好的，但整个过程中最容易出错的步骤是逆转录（RT）反应。

不过，最近又涌现出一些检测miRNA的新颖方法。第一种方法称为SplintR-qPCR，它保留了qPCR检测过程，但改变了cDNA合成的过程。这种方法利用SplintR连接酶将与miRNA互补的探针A和探针B相连接，以取代RT过程。由于DNA探针与miRNA之间只需要4-6 bp的重叠，故在设计探针时具有更大的灵活性。

第二种方法是基于免疫分析的miRNA定量方法——miREIA。此方案是利用DNA探针与miRNA靶点进行杂交，然后再利用独特的单克隆抗体对DNA/RNA杂交体进行定量。它的检测原理与ELISA相似，使用常规ELISA设备，便于临床实验室开展。整个过程不涉及到RT或扩增。

在此，研究人员比较了这三种检测方法在临床应用中的表现。他们利用赛默飞的TaqMan miRNA assay或TaqMan Advanced assay开展RT-qPCR；或利用NEB的SplintR连接酶按照文献中的方案开展SplintR-qPCR；或采用BioVendor的miREIA方案进行检测。他们检测了30个样本中miR-142-5p、miR-23a-3p和miR-93-5p的浓度。

研究人员发现绕开RT过程的方法所测得的浓度具有一致性，而RT-qPCR方法测得的浓度有三个对数的偏移，即测出的浓度大约高了1000倍。他们推测，可能的原因在于RT步骤本身。miRNA分子的长度仅为19-23个核苷酸，且序列非常相似，这就使得RT的引物设计非常复杂。

之后，他们又评估了这三种检测方法的稳健性。结果表明，miREIA技术的稳健性最佳，对于全血和PBMC样品，变异系数（CV）分别为17%和8%。SplintR-qPCR的结果很相似，CV分别为19%和16%。不过，RT-qPCR方法的稳健性最差，CV分别为39%和50%。

基于此，研究人员认为绕开RT过程的miRNA检测方法更适合临床应用。不过，RT-qPCR仍然是最灵敏的方法，在miRNA测定中无疑将占有一席之地。同时，SplintR-qPCR和miREIA方法更加稳健，绝对定量更精准。它们适用于以组织和全血为样本的临床实验室，但在灵敏度方法还需要进行一些开发工作。