相信大家作为实验小白，刚进实验室时，学的第一个实验就是提质粒。

想当年我们作为化学转生物的研究生刚进实验室时，觉得好酷炫的技术，跟在师兄后面，认真的对每一步的步骤都做好笔记，后来才发现你自己不过是做了一份手写版的说明书。

接下来的 N 年里，就是转化，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，酶切，连接，好想能够有一个提质粒机器人，实现自动化生产。当我们习惯了省时省力，或许我们都已经连提取的原理都已经忘了。

那么如何避免成为一个机器人呢，我想不仅仅是要提的出质粒，还要在出现问题时知道如何找到原因并解决，这样你就可以被称为人工智能，简称 AI。

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介，常用的方法有煮沸裂解法，碱提法等。而我们常用的 kit 是采用碱提法。


不同品牌的试剂盒具体操作步骤可能不同，但这个万变不离其宗，基础知识点还是不变的。

菌体在强碱性条件下裂解，释放出包括质粒在内的核酸，蛋白等物质。

当 pH 恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA 复性快，而线性的染色体 DNA 复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA 会相互缠绕成大型复合物，而后者被十二烷基硫酸盐包盖。

当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒 DNA。

未提出质粒或者得率较低？

1、菌。用错板子导致菌没有长起（抗生素的种类和浓度）

摇过夜一不小心第二天忘记了此时多半菌液老化

2、碱裂解不充分。高速离心收菌倒掉上清后，最好能弹弹弹（弹不走鱼尾纹）

3、溶液使用不当。看清哪些溶液应加热到一定的温度才能使用；哪些又是应该 加入醇之后使用

4、拷贝数较低或者菌体中无质粒。低拷贝数载体常常导致质粒 DNA 提取量过低；质粒在某些菌体中经过多次转接可能出现丢失；

基因组 DNA 或蛋白质污染！

1、加溶液 2 后不要剧烈摇晃，溶液 2 处理时间不能太久，一般颠倒 6-8 次即加溶液 3 中和，碱裂解时间过长容易产生基因组污染；

2、加溶液 3 后要混合充分，离心后取上清小心不要吸到白色沉淀；

3、不要使用过多菌体。溶液 P1、P2、P3 处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心。

不过我们也不能死搬硬套，也要学会融会贯通，举一反三，当出现超出大纲范围的题目如出现 15kb 的大型质粒，这时要注意采用温和的方法（溶菌酶法），因为剧烈的方法容易使它受到破坏。

俗话说的好，每日一提，强身健体。不过小提怡情，大提还需谨慎啊，当听说曾经发生过由于没有配平而出现离心机直接旋出甚至将天花板损坏的壮观场景，你们能想象我如今坐在高速离心机旁边的心情吗，（幸好我买了保险）。