酱油是一种源自我国的传统调味品，在人们的日常生活中占有重要地位。传统酱油酿造是以大豆和小麦为主要原料，经过微生物及其酶系的长期作用，最终形成特殊的色泽和良好的风味。随着生活水平的提高，人们对酱油品质和特色化的需求也逐渐增加。酱油发酵是一个混菌发酵过程。

一、 材料与方法

1 实验材料

1.1 酱醪样品

1.2 培养基：细菌分离培养基：乳酸菌分离使用添加 0.1%纳他霉素的 MRS 培养基，其他细菌分离使用添加 0.1%纳他霉素的营养肉汤培养基。高盐培养基(g/L)：葡萄糖 20.0、蛋白胨 10.0、酵母膏 10.0、可溶性淀粉 10.0、吐温-80 1.0、氯化钠180.0，pH 5.5。

1.3 主要试剂和仪器：干酪素、2-辛醇、有机酸混合标准品、氨基酸混合标准品、邻苯二甲醛(OPA)酶标仪、HPLC 分析仪、GC-MS 分析仪。

2 实验方法

2.1 酱醪中细菌的分离筛选：选取发酵第 25、56、120 天的酱醪样品分离菌株。称取25 g 酱醪于三角瓶中，加入 225 mL 无菌生理盐水并加适量玻璃珠，100 r/min 振荡 5 min 后，取少量菌悬液用生理盐水10 倍梯度稀释。将 10–3、10–4、10–5 梯度稀释液分
别涂布到细菌分离培养基平板上，37 °C 培养 2 d。挑选不同菌落形态的单菌落分离纯化，分离得到的菌株分别编号并转接于斜面培养基中 4 °C 保存用于后续研究。

2.2 细菌属种鉴定：细菌基因组 DNA 快速抽提试剂盒提取所筛选菌株的基因组 DNA，并以此为模板利用通用引物 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增其16S rRNA 基因。PCR 反应体系(50 μL)：50 mg/L 模板 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，Pfu PCRMasterMix 25 μL，双蒸水 21 μL。反应条件：94 °C 3 min；94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 2 min，30 个循环；72 °C 10 min。测序结果与NCBI 数据库中序列进行比对，并利用 MEGA 6.0软件构建进化树。

2.3 菌株耐盐性分析：在 MRS 培养基中将筛选到的酱油微生物分别培养到对数生长期，6 000 r/min离心 5 min 后收集菌体，转接到高盐培养基中 30 °C静置培养，采用活菌计数法测定培养 0−10 d 的活菌数。

2.4 蛋白酶和糖化酶活性测定：取 1.2.3 中各油微生物在高盐培养基中培养 1 d 后的培养液测定蛋白酶和糖化酶酶活。蛋白酶活力测定采用福林酚法，定义在 pH 5.5、18%氯化钠浓度以及 30 °C条件下，1 h 水解干酪素产生 1 μg 酪氨酸为一个蛋白酶活力单位；糖化酶活力测定采用 DNS 法，定义在 pH 5.5、18%氯化钠浓度以及 30 °C 条件下，1 h 水解可溶性淀粉产生 1 μg 葡萄糖为一个糖化酶活力单位。

3 数据分析使用 SPSS 19.0 软件对数据进行相关性分析，所有试验均重复3 次。