对流免疫电泳实验步骤1. 琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10毫升，小玻片约需3.5毫升，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散试验。

2. 加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。

图5 对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图

3. 电泳

用国产普通电泳仪。其内加0.05 m PH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2~4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2~3毫安/厘米，即大板为20毫安，小板为10毫安。电压为4~6伏/厘米。通电45分钟~2小时后观察结果。

4. 结果观察：在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

5. 影响结果的因素

（1） 抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。

（2） 几组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之。Tris缓冲液更差。

（3） 电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择每厘米5毫升，电泳时间改为1.5小时。对流免疫电泳实验步骤