反义RNA的二级结构对双螺旋的形成至关重要。因为形成双链结构必须克服正义和反义RNA本身的二级结构，比潜在自由能的绝对量更重要的是形成双螺旋的作用能量，也就是说，双螺旋构象是由动力学控制的，而不是由释放的自由能的绝对量控制的。原核生物中自然发生的RNA可以很好的说明RNA结构与形成双螺旋构象的速度之间的复杂关系。Simons和Kleckner指出，许多非常有效的反义RNA通常较短（约70个核苷酸），含有一个典型的茎环结构。例如大肠杆菌R1质粒的拷贝数受反义 RNA cop A的控制。Nordstroem和合作者详细研究了这一系统，其正义和反义RNA由同一DNA编码，但以相反方向转录。因此，点突变一点也不能改变这两种RNA的互补性，但是当同时改变正义和反义RNA环区时，虽然两条RNA链完全互补，但结合率下降了三至四倍。与此同时，质粒拷贝数却增加了。很显然，结合率受正义和反义RNA二级结构的影响。两条RNA链形成双螺旋的初始“吻合”结构非常重要。

毫无疑问，内源的正义RNA不能被改变，但反义RNA的靶结合区及反义RNA的长度是可以改变的。这将影响反义RNA的二级结构，从而改变其结合能力，使其与靶RNA结合更有效。Rittner等令人信服地证明了反义RNA的长度与它的结合率之间的复杂关系。他们用一个5¹端长度固定的人免疫缺陷型I型病毒（HIV-I）的反义RNA，改变其3¹端，从而改变了RNA长度。然后选择能够快速结合的反义RNA，发现结合率长度之间的关系依长度和相应二级结构的不同而摆动。3¹端只有几个核苷酸不同的反义RNA结合率变化可达上百倍。这与反义RNA的二级结构的改变有关。而且，体外的结合率与体内抑制HIV-I增值的有效性一致。这些结果也证明了在体内应用反义RNA抑制靶基因之前，在离体条件下实验的重要性。