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细胞抗抗生素的方法

提供者：上海研生实业有限公司发布时间：2016/12/1 14:20:18 阅读次数：410次进入该公司店铺

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细胞抗抗生素的方法

1．加2～3ul纯化的连接反应物（最大值为0.3ug DNA）到80ul的Top10F’电转化感受态细胞中，轻轻摇晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制电转化效率。

2．将细胞+DNA悬浮液转移到已冷却的0．2 cm细胞电转化管，并冰浴3分钟。

3，将Gene Pulser Plus电穿孔仪设置为2．5kV脉冲，电容器设为25uF，脉冲控制器设为200ns。

4．用纸巾干燥电转化管，然后将它放在电转化箱中，使用一个脉冲（寄存时间常量必须为4．5～5．0毫秒）。

5．立即加lmlLB到电击管中，打散细胞，然后将细胞悬浮液转移到15ml聚丙烯试管中。

6．在37℃下振荡，使细胞能够表达抗抗生素的标记。

7．组合所有的电转化样品，通过100ul适当稀释后均匀地倒在小LBAT平板上来确定文库的大小，用pUCl9控制电转化能产生大约3×107的转化产物。

8．在20℃，2500g下旋转组合电转化样品15分钟，在0．5XLBAT起始体积中打散沉淀颗粒，将1 ml细胞悬浮液涂抹在每一平方LBAT平板上。

9．在37℃过夜孵育该板。

10．在每个平方板上洒上10ml LBAT以获得文库，，用无菌延辗机敲碎细胞，将已打散的细胞转移到50ml聚丙烯试管中。

11．重复实验方案12．10，用5m1 LBAT除去板上留下的细胞。

12．在600nm测量细胞悬浮液的光密度（OD），如果有必要，可以将浓缩的细胞系稀释到每毫升LBAT 40 OD600nm单位。

13．制备甘油菌，将5ml的甘油加到5ml的浓缩细胞系中，混合后均等地分到1m1聚丙烯冷冻管中，在-70℃冷冻及储存，最后细胞浓度将是每毫升20 OD600nm位，这大约是每毫升1．6×1010个细胞。

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