主要用途

YIJI植物P型ATP酶（P type ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用P型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在钒酸盐存在与否的情况下，受到P型 ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等P型ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosinetriphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），属于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型ATP酶，又称为E1-E2 ATP酶，通常由一条或两条多肽构成，且呈现两种主要的结构构象E1和E2。这类ATP酶存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括离子和磷脂，例如H⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等。P型ATP酶可以分成4种，Ca²⁺传输性、Na⁺-K⁺/H⁺-K⁺传输性、H⁺传输性和所有细菌型等。基于ATP，在P型ATP酶抑制剂钒酸盐（vanadate） 存在与否的情况下，受到P型ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析P型ATP酶的特异活性。其反应系统为：

产品内容

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI缓冲液（Reagent C） 毫升

YIJI酶促液（Reagent D） 微升

YIJI反应液（Reagent E） 毫升

YIJI底物液（Reagent F）毫升

YIJI阴性液（Reagent G）毫升

YIJI专性液（Reagent H）毫升

产品说明书1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

DOUNCE匀浆器：用于组织匀化

微型台式离心机：用于样品制备

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光谱分析的容器

分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、 样品准备（总蛋白制备）

1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入适量的（xx克组织需要xx毫升）YIJI清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎组织

5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6． 加入预冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）

7． 涡旋震荡5秒，充分混匀

8． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）

9． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管

11． （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12． 即刻移入到1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJIBradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）

14． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1． 准备好待测样品，置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零

3． YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）

5． 放进37℃培养箱里静置3分钟

6． 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数30分钟

四、样品总活性测定

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）

5． 放进37℃培养箱里静置3分钟

6． 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数30分钟

五、样品非特异活性测定

1. 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2. 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）

3. 加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）

4. 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）

5. 放进37℃培养箱里静置3分钟

6. 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）

7. 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数30分钟

六、 计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

2）样品特异活性

注意事项

1． 本产品为21次操作（10个样本），包括背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等

5． 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定

6． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟

7． 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性

8． 光谱测定后，比色皿须清洗彻底

9． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供YIJIBradford蛋白质浓度定量试剂盒YJ30030.1）

10． 样品特异活性是指钒酸盐敏感的P型ATP酶

11． P型ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

12． 本公司提供系列ATP酶类分析技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确

订购信息

单组分订购信息

编号名称规格

YJ50246.5YIJI植物P型ATP酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒20次

YJ50246.5AYIJI清理液（Reagent A）毫升

YJ50246.5B YIJI裂解液（Reagent B）毫升

YJ50246.5CYIJI缓冲液（Reagent C）毫升

YJ50246.5DYIJI酶促液（Reagent D）毫升

YJ50246.5EYIJI反应液（Reagent E）毫升

YJ50246.5FYIJI底物液（Reagent F）毫升

YJ50246.5GYIJI阴性液（Reagent G）毫升

YJ50246.5HYIJI专性液（Reagent H）毫升

YJ30030.1YIJIBradford蛋白质浓度定量试剂盒200次