多酚氧化酶的纯化和活力测定
目的要求
1、学习多酚氧化酶的提取和纯化方法
2、掌握多酚氧化酶活力测定的原理和方法
实验原理
很多植物受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色，这是损伤时植物细胞破碎，原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。
多酚氧化酶是一种铜酶，它能够催化酚类物质转变成醌。近几十年来，国内外对植物组织褐变的研究表明，组织的褐变主要是PPO作用于天然底物酚类物质所致。
试剂和器材
1、试剂
0.25mol/L磷酸钾缓冲液（ph7.2）；0.15mol/L儿茶酚溶液；10mmol/L Tris-HCI溶液（pH8.3）；硫酸铵。
2、材料
梨
3、器材
组织匀浆机，漏斗，滤纸，分光光度计。
操作方法
1、多酚氧化酶（PPO）的提取
（1）|丙酮粉制备。取果肉组织100g，加入200mL，冰丙酮（—20℃左右），用高速组织捣碎机均浆5min，混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤，残渣用冰丙酮反复冲洗，过滤，直至成为白色粉末，此粉末即为丙酮粉。
（2）、酶液制备：称取1g丙酮粉，加入20mL，0.025mol/L磷酸缓冲液（pH7.2），0℃下用磁力搅拌器均浆30min，在12000r/min下离心30min，取上清液，得粗酶提取液。
2、多酚氧化酶的纯化
向上述酶液中加入NH4SO4至为80%饱和溶液，搅拌30min，过夜，于12000g离心30min，沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2），对10mmol/L，Tris-HCI(pH8.3)透析18h，期间更换3次，即为纯化多酚氧化酶。
3、多酚氧化酶活力的测定
以儿茶酚为底物，在1cm的比色杯中加入2.75mL，0.25mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2），0.1mL，0.15mol/L儿茶酚溶液，混匀，室温下放置3min后，加入0.1mL酶液，5s后开始扫描1min内A420值的变化，酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。
注意事项
多酚氧化酶易失活，提取酶时宜在低温下进行。
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