方法同SP法。

二、第一抗体的染色

1、将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10min，PBS冲洗3min×3次;

2、加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10min，倒掉(不能冲洗);

3、加入一抗(按照说明书推荐浓度和孵育条件);

4、使用含有0.05%吐温20的PBS(TPBS)，冲洗5min×3次;

5、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10min;

6、用TPBS冲洗5min×3次;

7、加入100ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗，室温孵育10min;

8、用TPBS冲洗5min×3次;

9、准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂4C，充分混匀;

10、加100ul(2滴)配好的AP底物溶液，室温孵育(镜下掌握孵育时间);

11、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。

三、第二抗体的染色

12、加100ul(2滴)双染增强剂(试剂7)，孵育;

13、用TPBS冲洗3min×3次;

14、加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10min，倒掉(不能冲洗);

15、加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件);

16、用TPBS冲洗5min×3次;

17、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10min;

18、用TPBS冲洗5 min×3次;

19、加入100ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗，室温孵育10min;

20、用TPBS冲洗5min×3次;

21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂6C，充分混匀;

22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液，室温孵育(镜下掌握孵育时间);

23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应;

24、 使用复染试剂染色(根据需要选择);

25、 封片剂(试剂8)封片，显微镜观察并拍照。

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