一、脱蜡和水化
方法同SP法。
二、第一抗体的染色
1、将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10min，PBS冲洗3min×3次;
2、加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10min，倒掉(不能冲洗);
3、加入一抗(按照说明书推荐浓度和孵育条件);
4、使用含有0.05%吐温20的PBS(TPBS)，冲洗5min×3次;
5、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10min;
6、用TPBS冲洗5min×3次;
7、加入100ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗，室温孵育10min;
8、用TPBS冲洗5min×3次;
9、准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂4C，充分混匀;
10、加100ul(2滴)配好的AP底物溶液，室温孵育(镜下掌握孵育时间);
11、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。
三、第二抗体的染色
12、加100ul(2滴)双染增强剂(试剂7)，孵育;
13、用TPBS冲洗3min×3次;
14、加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10min，倒掉(不能冲洗);
15、加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件);
16、用TPBS冲洗5min×3次;
17、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10min;
18、用TPBS冲洗5 min×3次;
19、加入100ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗，室温孵育10min;
20、用TPBS冲洗5min×3次;
21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂6C，充分混匀;
22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液，室温孵育(镜下掌握孵育时间);
23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应;
24、 使用复染试剂染色(根据需要选择);
25、 封片剂(试剂8)封片，显微镜观察并拍照。
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