1．聚乙二醇诱导细胞融合法

(1)原理：聚乙二醇(polyethyleme，PEG)是一种白色蜡状粉末，有轻微臭味，可溶于水，PEG分子量在200～6000范围之内者均可用作细胞融合剂，一般以分子量为1000的效果较好。PEG诱导细胞融合的机制不十分清楚，但目前认为，PEG能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，在双分子层质膜的相互亲和及彼此的表面张力作用下发生融合。

(2)材料

1)细胞：HGPR细胞、TK细胞系。

2)50％PEG溶液：称取10g PEG，经高压灭菌10min，待冷却到50℃左右时加入10ml温热的未加血清的Eagle MEM培养液混匀；如果配制过程中PEG凝固，可以在酒精灯上稍加热使其溶解，用NaHCO3。调pH至8．O。

3)细胞培养液：HAT培养液、Earle盐溶液、无血清的Eagk MEM培养液、生长培养液(通常为含lO％FBS的Eagk．MEM培养液)。

(3)方法

1)将两种不同亲本的细胞各lml(约含107个细胞)混匀，以1000r／min离心10min除去上清液，使之剩余体积约为lml，用手指轻弹管底部，使两种细胞混匀。

2)将离心管置于37℃水浴锅中，逐滴向离心管中加入0．5ml 50％PEG溶液，边加边振荡，使PEG与细胞充分均匀接触，1min内加完，静置90s。

3)立即加人5ml 37℃预热无血清的Eagle MEM培养液使PEG稀释，停止作用。以1000r／min离心．10min使细胞沉降，弃上清液，此时细胞已经融合。

4)用无血清培养液洗2次，加入含15％～20％FBS的HAT培养液，用吸管混匀，接种于96孔培养板上，每孔0．1ml，37℃5％CO2孵箱中培养24～48h后选出融合细胞。

(4)结果观察：为了便于观察到细胞融合的形态，需要对细胞进行染色。除Janusgreen染色外，也可选择HE染色或姬姆萨染色。在相差显微镜下观察，PEG处理2min内即可见许多正在融合的细胞。

(5)注意事项

1)PEG处理时间不能太长，否则会有多个细胞彼此融合成巨大的合胞体，合胞体不能存活。

2)影响细胞融合的因素很多，其中对PEG要求更严格。实验时最好选择分子量在1500～6000(视细胞种类不同来定，也可参考文献)；PEG的浓度以50％为好。

3)细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。最佳温度应控制在37℃～39℃内。

4)pH值也是影响细胞融合成功与否的关键因素之一。所配的试剂溶液pH值应控制在7．O～7．2。

2．电诱导细胞融合法 ．

(1)原理：1981年，scheurich和Zimrnermaml发明了电诱导细胞融合法，具有细胞融合过程容易控制、融合频率高、无毒性、机制相对比较清楚等优点，近年来得到迅速发展和应用。其原理是：使细胞在正弦电场下极化成偶极子，并向两级靠近，在靠近的过程中，有些细胞彼此吸引连接在一起，成串排列在两级之问。然后，施加以高强度、短时程的方波刺激，把相互连接的两个或多个细胞的质膜击穿而导致细胞融合。

(2)材料

1)BALB／C小鼠。

2)SP2／0骨髓瘤细胞。

3)脉冲缓冲液(PM)：用于洗涤B细胞和骨髓瘤细胞，以及作为加交流、直流电场时的介质。含蔗糖280mm／L、乙酸镁0．5mmol／L、乙酸钙O．1mmol／L，用电阻率大于106Ω·cm的三蒸水配制，高压灭菌，4℃保存备用。

4)融合后液(PMF)：用于电穿孔后使孔洞完善化。含NaCl 132mmol/L、KCl8mmol／L、NaH2PO4 4mmol／L、NaH2PO4 6mmol／L、乙酸镁O．5mmol／L、乙酸钙0．1mmol／L、用电阻率大干106Ω·cm的三蒸水配制，高压灭菌，4℃下保存备用。

5)HAT培养液、RPMI 1640培养液。

(3)方法

1)细胞的准备

①SP2／O骨髓瘤细胞：融合前1d将实验所用SP2／O骨髓瘤细胞传代，使实验时骨髓瘤细胞处于指数生长期。将该细胞收集于离心管中，以1000r／mln离心8min。弃上清液，给细胞沉淀加10ml不含血清的RPMI 1640培养液，将细胞悬浮备用。

②淋巴细胞：实验用淋巴细胞取自经3次用目的抗原免疫的BALB／C小鼠脾脏，每次免疫间隔2～3周，最后一次免疫后3～4d，将小鼠处死，取出脾脏，加10ml不含血清的RPMI1640培养液、将细胞用200目不锈钢网研磨、分散，制成细胞悬液，以1000r／min．离心8min。弃上清液，用培养液洗涤1次。加入10ml不含血清的RPMI 1640培养液，将细胞重新悬浮备用。

③饲养细胞：融合后培养所用的饲养细胞取自健康BALB／C小鼠腹腔巨噬细胞。融合前，将收集的巨噬细胞悬液以1000r／mln离心8min，弃上清液。加入25ml HAT培养液．混匀，分别接种到24孔或96孔培养板上。经培养后形成的滋养层细胞可用于辅助新的融合细胞的生长。

2)细胞融合

①将B细胞和骨髓瘤细胞按l：5比例混合，细胞浓度为1．5×107／ml，将细胞悬液1000r／min离心8min，细胞沉淀用PM洗2次。

②将细胞沉淀重新悬浮后注入电极的小池，然后施加如下电场条件：电解质电泳的交流电场频率为1MHz，振幅为250V／cm，施加，30s。在显微镜下观察，当看到80％以上细毫已形成串珠时，立即加穿孔电脉冲。其参数为：脉冲幅度5 kV／cm，时间常数20μs，脉一个数5个，间隔1s。

③室温下静置10min。再用5ml PMF将融合后的细胞冲洗取出，置于37℃下置育20min。

④以1000r／min离心8min。在细胞沉淀中加入25ml HAT培养液，混匀。分别接种到24孔或96孔培养板上，置37℃孵箱中培养12～24h。

(4)结果观察：细胞融合后12～24h，将细胞接种到HAT培养液中，细胞密度在60%～80%汇合率之间，容许细胞进一步生长，进行异核体筛选，4～14d后可观察到大集落的杂交瘤细胞克隆。