(一)原理

Western blot与southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Westem blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

1．试剂30％丙烯酰胺储存液、10％SDS溶液、分离胶缓冲液、积层胶缓冲液、10％APS溶液、转膜缓冲液、TBST洗液、5％脱脂牛奶封闭液、6×loading buffer、l×电泳缓冲液、TEMED原液、蛋白质分子量标准、一抗，二抗、ECL试剂、甲醇。

2．器具电转仪、水浴振荡器、紫外凝胶成像系统、恒温金属浴、低温冷冻高速离心机、暗盒、保鲜膜、Whatman 3mm滤纸、X光片、剪刀、镊子、刻度尺。

1．SDS—PAGE

(1)向蛋白样品(培养物上清液、细胞裂解液等)中加入1／5样品体积的6×loadingbuffer(pH6．8)，100℃，煮沸10min。

(2)4℃，12000r／min，离心10min，静置备用。

(3)制备分离胶。

(4)按顺序加入各种试剂，快速混匀分离胶溶液，加入固定好的玻璃夹层中，凝胶加至距离前玻璃板顶端1．5cm或距离梳子齿0．5cm，在液面上缓慢加入异丁醇(或无水乙醇)℃室温聚合约30min。

(5)倾去顶层液体，先用去离子水轻柔冲洗几遍，再用吸水纸吸干。注意不要碰到胶面。

(6)制备5%积层胶。

(7)快速混匀将积层胶溶液，连续加至分离胶上，直至达到前玻璃板顶端。

(8)用去离子水冲洗梳子几遍后甩干，呈铡刀样插入灌好的积层胶溶液内，避免引入气泡。室温聚合约30min。

(9)凝胶聚合后，为了防止凝胶与梳子上边粘连，先用针头分离再小心拔出梳子。

(10)组装电泳装置，向电泳槽中加入1×电泳缓冲液，没过加样孔。

(11)上样：30μl／孔(1．5mm梳子)，10μl／孔(O．75mm)，无样品孔用1×loadingblaffer填充。

(12)电泳：60V30min，100V3．5h。

注：不同分子量的蛋白样品，电泳的条件不同；该条件仅作为120～140KD蛋白电泳的参考条件。

(13)染色：取30ml考马斯亮蓝R一250染液，加入一个玻璃平皿中，小心将凝胶放入其中，平板摇床中振荡染色2h。

(14)脱色：将染色后的凝胶取出，用去离子水简单冲洗几遍，放入装有去离子水的铝制饭盒内，加热至煮沸，密切观察凝胶脱色情况。

(15)脱色完全后(大约10min)，取出凝胶，拍照，在去离子水中短期保存。抗体

2．转膜(半干转)

(1)电泳结束后，小心取出凝胶，用去离子水冲洗一下，放入电转液中平衡30min。

(2)按凝胶大小剪一张PVDF膜，放入甲醇中浸泡2min，水中洗5min；再剪六张大小相同的滤纸，连同PVDF膜一起浸泡于电转液中30min，排除气泡。

(3)用电转液润湿电转仪的石墨表面，然后从下到上依次放置3层滤纸、PVDF膜、凝胶、3层滤纸，精确对齐。

(4)组装电转仪，通电，室温，9V，1.5～2．5h(根据蛋白分子量选择转移时间)。

3．封闭

(1)取出PVDF膜，浸润于5％脱脂牛奶封闭液中，液体尽量多，减少非特异性结合。

(2)4℃封闭过夜。

(3)弃去封闭液，用TBST洗膜三次，每次5min。

4．杂交

(1)一抗：用封闭液1：200稀释，按照O．1ml／cm2比例加入一抗。37℃，70～80r／min，1h(或4℃过夜)。

(2)洗膜：弃去一抗，先用TBST冲洗一次，再用TKST洗膜4～6次，平台摇床，每次≥5min。为防止背景过高，使用的洗液应足量。

(3)二抗：用封闭液1：500～1：2000稀释二抗储存液，按O．1ml／cm2加入二抗，平台摇床，37℃，70～80r／min，1h。

(4)洗膜：同(2)。

5．显色

(1)进入暗室，戴手套操作。

(2)在工作台上铺一张保鲜膜，将PVDF膜蛋白面向下置于保鲜膜上；将stable peroxide solution和lunlind／enharlcer solution按照1：l混合，按O．125ml／cm2(膜面积)均匀加在PVDF膜上，作用5min。

(3)用保鲜膜将PVDF膜包好，排除所有气泡。蛋白面向上放入暗盒中。

(4)关闭光源，可用红灯，小心取出底片，放在膜上，曝光。

(5)将底片放人显影液中5min，用去离子水漂洗一下；放入定影液中3～5min，直至可见清晰条带，用去离子水漂洗终止反应。

(四)注意事项

1．实验全程戴一次性橡胶手套。

2．过硫酸铵配制成10％溶液后，应当一20℃保存。同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。

3．TEMED宜避光保存。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。抗体

4．过硫酸铵、丙烯酰胺储存液有挥发性，聚合前具有神经毒性，配胶过程中尽量减少空气中暴露的时间。

5．转膜时确保PVDF膜位于阳极侧，凝胶位于阴极侧。

6．一抗、二抗作用后，洗膜要充分．减少背景。