乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白
(一)仪器与薄膜的准备
1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择
用竹夹子取一片薄膜,小心地平放在盛有缓冲液的平皿中,若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳;若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点等,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后,方可用于电泳。
elisa试剂盒2.电泳槽的准备
根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,因而称为滤纸桥。
3.电极槽的平衡
用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽,使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态,一般需平衡15——20min。注意,取出平衡装置时应将活塞关紧。
(二)点样
1.制备点样模板
取一张干净滤纸(10×10cm),在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线,此线为点样标志区。
2.点样
用竹夹子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时,先用玻璃棒或血色素吸管取2—3µL血清,均匀涂在加样器上,再将点样器轻轻印在点样区内,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样。
ELISA试剂盒(三).电泳
用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上,要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜,则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10min。
用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接,注意不要接错。在室温下电泳,打开电源开关,用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA)。通电10—15min后,将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA),电泳时间约50—80min。电泳后调节旋扭使电流为零,关闭电泳仪切断电源。
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色
用解剖镊子取出电泳后的薄膜,放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中,浸染5min,取出后再用漂洗液浸洗脱色,每隔10min 换漂洗液一次,连续数次,直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上,用吹风机的冷风将薄膜吹干。
(五)透明
将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡,约2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平。此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。
ELISA试剂盒(六)结果判断与定量
血清蛋白电泳经蛋白染色后,可显示出区带,未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法,测定各蛋白组分相对百分含量。

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