1.固定

可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。


2.封闭(Blocking)

加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样 品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。


3. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。

用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果 一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。

回收一抗。加入免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。
如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。


4. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗。加入免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。细胞


5. 蛋白检测(Detection of proteins)

对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。

对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物，或AB检测体系等进行后续检测。


6. 多重染色(Multiple staining)

如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应，例如DAB染色，一般不适合再进行多重染色。


多重荧光染色：
可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。


用HE染色进行复染：
免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)进行HE染色。