实验步骤

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配） ，再次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物设计应注意如下要点：

1．引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp。

2．引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。

3．引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

4．引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5．引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。合理的退火温度从55℃到70℃。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

6．引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。应该尽量避免。