细胞膜与胞内蛋白提取试剂盒的使用方法

本试剂盒能够从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮细胞中制备细胞 膜与胞内质膜组分。其试剂成分与优化的制备方案使胞膜制备过程简单易行，无需特殊设备和超速离心，可在1小时内完成。应用本试剂盒制备的胞膜是细胞 膜和细胞器膜如线粒体、内质网及质膜的混合物。制备得到的产物纯度可胜任后续的免疫沉淀、蛋白印迹、2-D gel、酶活性检测和受体分析等实验。

组成：（以下是50次规格用量）

CER (Cytosol Extraction Reagent) 25ml

MER (Membran Extraction Reagent) 2.5ml

Suspension Buffer 10ml

储存：各组分4度 有效期12个月

操作步骤：

一．样本预处理：

收集细胞：（在每一次制备过程中，使用等量的细胞数将明显提高后续检测结果的一致性，因此建议在制备前对细胞准确计数）

1. 贴壁细胞：用PBS缓冲液冲洗细胞平皿，用胰蛋白酶消化细胞。800g离心5-10分钟，弃上清，用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

2. 悬浮细胞：800g离心5-10分钟，弃上清。用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。

以下制备过程要在4 oC或冰水浴中进行

二．组织细胞匀浆裂解

1. 细胞匀浆裂解

向每1x107个细胞或每100µl（细胞离心后的体积）细胞沉淀中加入500µlCER试剂，震荡重悬，冰浴2分钟。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中上下手动匀浆20-30次。

注意：此破碎细胞步骤为关键环节。要使用1-3ml小容积玻璃匀浆器，须选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关，可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应小于5%。

2. 组织块匀浆裂解：

取250mg哺乳动物新鲜或-80 oC冻存组织块放入冰预冷的玻璃匀浆器内，加入500µlCER试剂。用研杵捣碎组织块，上下手动匀浆20次，冰浴10分钟，然后上下手动匀浆7次。

注意：与培养细胞特别是贴壁细胞相比，组织块中的细胞在匀浆时较易破碎，因而并非必须选择间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密，会使组织匀浆困难，可选用研杵与套管稍松的匀浆器，破碎效果与组织细胞类型有关，可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。

三、粗提物制备：

取约500µl裂解物，转移到新的离心管中，800g ,4oC离心5分钟。上清为胞膜-胞浆混合物。

四、胞膜胞浆制备：

1）将步骤三获得的上清转移到新的离心管中，估计上清的体积； 2）加入上清液1/10体积的MER与上清液混合，冰浴5分钟；3）14,000rpm，4oC离心30分钟；4）沉淀为胞膜组分，含有细胞 膜和亚细胞器碎片，可短暂离心除尽液体，用50-100µl Suspension Buffer重悬备用或用RIPA裂解胞膜；做WB时膜蛋白分子量100KD以上的建议用较强的蛋白提取试剂如加强的RIPA，便于获取溶解度低的膜蛋白，具体方案根据试验目的确定。

说明：

1. Suspension Buffer不含去垢剂，重悬于Suspension Buffer中的胞膜或胞核组分呈不溶解状态是正常的，用户可用自备溶液重悬胞膜或胞核成分。如果进行蛋白印迹、2-D get等实验，用户可用SDS上样缓冲直接裂解细胞 膜或细胞核成分。对于进行免疫共沉淀实验来说，可用RIPA裂解液（C1053）重悬胞膜。

2. 试剂盒各组分中未添加蛋白酶抑制剂，可自行选择添加。

细胞膜与胞内蛋白提取试剂盒的使用方法