免疫组化操作流程
（一）仪器设备
1. 18cm 不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴锅
（二）试 剂
1. PBS 缓冲液（ph7.2 ―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L.
2．0.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA 缓冲液（ph8.0 ）：700ml 水中溶解186.1g EDTA&
8226;2H2O,用10mmol/L
NaOH 调至ph8.0,加水至1000ml.
4. 1mol/L 的TBS 缓冲液（ph8.0 ）：在800ml 水中溶解121gTris 碱，用1N 的HCl 调至ph8.0,
加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12（ph7.8）配制。b.0.4% 胃蛋白酶液：用0.1N
的HCl 配制。
6. 3% 甲醇―H2O2 溶液：用30%H2O2 和80%甲醇溶液配制
7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（ph9.0 –9.5）等量混合
b 油和TBS（PBS）配制
8．TBS/PBS PH9.0 –9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4 适合光学纤维标本
（三）操作流程
1 脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60 分钟或60℃恒温箱中烘烤20 分钟。 a
组织芯片置于二甲苯中浸泡10 分钟,更换二甲苯后在浸泡10 分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2 抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：
A 抗原热修复
a 高压热修复在沸水中加入EDTA（ph8.0）或0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0 ）.盖上不锈钢
锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，
然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去
后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01 枸橼酸钠缓冲液（ph6.0 ）至95℃左右，放入组织芯片 加热10-15 分钟。
C 微波炉加热 在微波炉里加热0.01 枸橼酸钠缓冲液（ph6.0 ）至沸腾后将组织芯片放入，
断电，间隔5-10 分钟，反复1-2 次。适用的抗原：
Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.
ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.P
KC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30 分
钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP.
Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
3 免疫组化染色 SP 法
（1）脱蜡、水化
（2 ）PBS 洗2-3 次各5 分钟
（3）3%H2O2（80% 甲醇）滴加在TMA 上，室温静置10 分钟
（4 ）PBS 洗2-3 次各5 分钟
（5）抗原修复
（6）PBS 洗2-3 次各5 分钟
（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20 分钟，甩去多余液体
（8）滴加Ι抗50 μl,室温静置1 小时或4℃过夜或37℃1 小时
（9）4℃过夜后需在37℃复温45 分钟
（10）PBS 洗3 次每次2 分钟
（11）滴加Ⅱ抗45-50 μl,室温静置或37℃1 小时
（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20.
（13）PBS 洗3 次各5 分钟
（14）DAB 显色5-10 分钟，在显微镜下掌握染色程度
（15）PBS 或自来水冲洗10 分钟
（16）苏木精复染2 分钟，盐酸酒精分化
（17）自来水冲洗10-15 分钟
（18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC 法
（1）脱蜡、水化
（2 ）PBS 洗2 次各5 分钟
（3）用蒸馏水或PBS 配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10 分钟，用蒸馏水洗3 次
（4 ）抗原修复
（5） PBS 洗5 分钟
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20 分钟，甩去多余液体
（7）滴加Ι抗50 μl,室温静置1 小时或4℃过夜或37℃1 小时
（8）PBS 洗3 次各2 分钟
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20 分钟
（10）PBS 洗3 次各2 分钟
（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20 分钟
（12） PBS 洗4 次各5 分钟
（13） DAB 显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。
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