ELISA 检测方法
注意事项：
在收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们建议新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检
测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集的标本，请造模取材后，将标本及时分装后
放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以一定要
避免反复冻融。
液体类标本：
*血清：室温血液自然凝固10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。
*血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心20 分钟左
右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
*尿液：用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，
应再次离心。胸腹水、脑脊液等参照此实行。
*细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上
清。检测细胞内的成份时，用PBS （PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100 万/ml 左右。通过反复
冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。
组织标本：
切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8
℃的温度。加入一定量的PBS （PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20 分钟左右（2000-3000
转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
ELISA 方法简介:
1. 包被抗原：稀释液pH 9.6 碳酸盐缓冲液，多肽（抗原）浓度2ug/ml，0.1ml/孔，4ºC 过夜，洗净。
2. 1%BSA （pH 9.6 碳酸盐缓冲液） 封闭，0.1ml/孔，37ºC1h，洗净。
3. 稀释抗血清（可稀释不同浓度） 0.1ml/孔，37ºC 30 分钟，洗净。
4. 稀释辣根过氧化物每标记的二抗 0.1ml/孔，37ºC 40 分钟，洗净。
5. 显色：TMB 显色
A 液：四甲基联苯胺10mg 溶于DMF1ml 中，再用pH5.0 柠檬酸缓冲液稀释100 倍.
B 液：5ul 双氧水加蒸馏水12.5ml。
终止液：2N 硫酸
A 液、B 液各一滴，比光显色10 分钟，终止液一滴。
6. 450nm 波长 测OD 值
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