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酵母DNA微量5ml的如何制备

提供者:森贝伽(南京)生物科技有限公司   发布时间:2013/12/26 15:19:03  阅读次数:281次  进入该公司店铺

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一. 酵母DNA微量制备(5ml)

1. 按酵母于5ml YPD中,置30℃培养过夜。
2.用医用离心机以2000r/min离心5分钟沉淀细胞,弃上清液。
3. 将细胞悬浮在0.5ml的1mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)缓冲液中,转动一支1.5ml离心管中。
4. 加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液,置37℃保温1小时。
5. 离心1小时。
6.弃上清液,把细胞悬浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2EDTA溶液。
7. 加0.05ml的10% SDS,混匀。
8. 置65℃保温混合物30分钟。
9.加0.2ml的5mol/L醋酸钾,把离心管在冰浴中放置1小时。
10. 离心5分钟。
11. 将上清液转移到一洁净微型离心管,室温下加入等体积的无水异丙醇,混匀,放置5分钟。短暂离心(10秒钟)弃上清液,让沉淀自然干燥。
12. 用0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮沉淀。
13. 加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液,置37℃保温30分钟。
14. 加0.03ml的3mol/L醋酸钠,混匀,用0.2ml的无水异丙醇沉淀,再短暂离心收集DNA。
15. 弃上清液,自然干燥,用0.1~0.3ml TE缓冲液(pH7.4)重新悬浮DNA。
16.在使用限制性内切酶酶解DNA之前,有必要将最终浓度溶液离心较长时间(15分钟)以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。

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