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酵母DNA微量5ml的如何制备
点击次数：282 发布时间：2013/12/26 15:19:03
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杨**
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一. 酵母DNA微量制备（5ml）
1. 按酵母于5ml YPD中，置30℃培养过夜。
2.用医用离心机以2000r/min离心5分钟沉淀细胞，弃上清液。
3. 将细胞悬浮在0.5ml的1mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2EDTA（pH7.5）缓冲液中，转动一支1.5ml离心管中。
4. 加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37℃保温1小时。
5. 离心1小时。
6.弃上清液，把细胞悬浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl（pH7.4）-20mmol/L Na2EDTA溶液。
7. 加0.05ml的10％ SDS，混匀。
8. 置65℃保温混合物30分钟。
9.加0.2ml的5mol/L醋酸钾，把离心管在冰浴中放置1小时。
10. 离心5分钟。
11. 将上清液转移到一洁净微型离心管，室温下加入等体积的无水异丙醇，混匀，放置5分钟。短暂离心（10秒钟）弃上清液，让沉淀自然干燥。
12. 用0.3ml TE缓冲液（pH7.4）重新悬浮沉淀。
13. 加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保温30分钟。
14. 加0.03ml的3mol/L醋酸钠，混匀，用0.2ml的无水异丙醇沉淀，再短暂离心收集DNA。
15. 弃上清液，自然干燥，用0.1～0.3ml TE缓冲液（pH7.4）重新悬浮DNA。
16.在使用限制性内切酶酶解DNA之前，有必要将最终浓度溶液离心较长时间（15分钟）以便除去可能抑制酶解的不溶性物质。
原创作者：森贝伽（南京）生物科技有限公司
