（一）材料与试剂
1．抗原 牛结核PPD。
2．血清 待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。
3．硝酸纤维膜 孔径0.45µm。
4．氯化金（优质）
5．0.2Mol/L PB液
6．0.05Mol/L Tris—HCl缓冲液
7．硝酸银显影液（现用现配）
明胶（20g/L） 6.00ml
对苯二酚（57.90g/L） 3.00ml
硝酸银（25g/L） 0.20ml
pH3.5柠檬酸盐缓冲液 1.00ml
对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存，临用前将明胶加热溶解后，按上述比例依次混合。
pH3.5柠檬酸盐缓冲液的配制：
柠檬酸（C6H8O7·H2O） 25.50g
柠檬酸三钠（C6H5Na3·2H2O） 3.50g
去离子水 加至 100.00ml
溶解后即可使用。
8．定影液
硫代硫酸钠（Na2S2O3） 20.0g
去离子水 加至 100.00ml
溶解即可。
9．兔抗牛IgG抗体。
（二）操作方法
1．胶体金的制备 试验用水均要求三蒸馏水并过去离子柱，最终去离子水的电阻大于100万Ω。所有容器最终均用去离子水清洗。
（1）采用鞣酸—枸橼酸钠还原法制备
A液 1％HAuCl4 2.00ml
去离子水 158.00ml
B液 1％枸橼酸钠 8.00ml
0.1％Mol/L K2CO3 0.20ml
1％鞣酸 0.20ml
去离子水 31.60ml
将A液和B液分别于60℃水浴30min，并不时搅拌，迅速将B液加入至A液中，搅拌，颜色为深蓝色，继续加热至100℃，5 min～10min，溶液颜色变为深红色，自然冷却后4℃保存。
（2）胶体金鉴定：外观呈深红色、晶莹透亮，迎着日光可见有光带。电镜观察胶体金粒子大小平均为10nm，颗粒大小一致，分布均匀。
2．胶体金与兔抗牛IgG用量比例的确定 每ml胶体金所需的最低稳定蛋白量是30µg，根据试剂用量增加20％，所以每ml胶体金所需的最低稳定兔抗牛IgG量为36µg。
3．金标记兔抗牛IgG的制备 取所需量的兔抗牛IgG，加入少许去离子水，用0.1Mol/L K2CO3溶液调pH值为9.0（用精密pH试纸测定），同时胶体金溶液的pH值也调至9.0。在磁力搅拌下，将20ml胶体金溶液加入至兔抗牛IgG中，继续搅拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇（分子量20 000）作为稳定剂，以使其最终浓度达到0.05％，再搅拌15min后，置4℃冰箱保存备用。
4．金标兔抗牛IgG的纯化 将金标记的兔抗牛IgG以2 500r/min离心15min，以除去胶体金的聚合物，取上清以65 000g离心1h，可见离心物分为三层，上层为淡黄色，含有未结合的兔抗牛IgG，下层为近黑色，是尚未结合的胶体金颗粒,最主要的中间层为红色，是结合良好的金标记的兔抗牛IgG，倾去上层，收集中层液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原体积的1／10，过滤除菌，分装，4℃保存备用。
5．金标记兔抗牛IgG的鉴定
（1）颗粒大小及均匀度鉴定：取少许金标记的兔抗牛IgG，负染，电镜观察颗粒大小及均匀度，并测量粒子直径大小。
（2）活性鉴定：将牛IgG点样于硝酸纤维膜上，直接加金标兔抗牛IgG抗体，应显示出明显的粉红色斑点。
6．正式试验程序
（1）点样 以打孔器将微孔滤膜制成直径3mm的膜片。将牛结核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀释为40µg/ml，用微量加样器加1µl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。
（2）封闭 将膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其间振荡数次。取出后以蒸馏水洗涤1次，用滤纸吸干。
（3）加待检血清 待检血清以PBST液做1︰160倍稀释。将膜片浸入其中，37℃作用1h，其间振荡数次。取出后，以PBST液洗涤后，滤纸吸干。此步同时设标准阳性血清和阴性血清对照。
（4）加金标抗体 以PBST液将金标液作1︰10稀释，将膜片浸入其中，37℃作用2h，中间振荡数次。
（5）银染 将膜片从金标液中取出，于去离子水洗涤3次，每次3min。然后将膜片浸入暗室中的银染色液中，室温下作用10min，移入定影液中，室温作用5min。然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果。
版权声明