细菌、酵母、真菌、霉菌、支原体以及其他的培养细胞都可能引起污染。

怎样识别污染

一、肉眼观察，把培养瓶或培养皿拿起来，对着光线检查。

• 浑浊情况。即使细胞密度很高，培养基也应该是透明的。轻轻移动或晃动培养瓶，观察培养基的浑浊或悬浮情况，一些霉菌可能会在培养基的表面形成菌落。
• 培养基颜色的变化。酸性条件下，加了酚红的培养基会由红变黄，而碱性条件下会变成红紫色。细菌污染常常会使培养基变成黄色，真菌污染会使培养基变成深紫红色。
• 闻！当然不能打开瓶子去闻，把鼻子贴在瓶口闻，许多污染发生以后都会散发出易察觉的、特殊的气味，甚至一打开培养箱门就闻到了。

二、显微观察。在倒置显微镜下，先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物镜（总放大倍数为400) 观察细胞培养皿或培养瓶中的细胞：

• 其他有机体。在低倍镜下，真菌的菌丝体成长棒状，并横穿整个视野，还可以观察到酵母，有时呈小圆球形，有时还有芽。

在高倍镜下可以观察到细菌，它们可能是棒状或球状，单独成链或成团存在，它们也可能和细胞混在一起，并且明显处于细胞内部，有些细胞可能已经裂解变得模糊。观察时可能每两个视野才出现一个污染（当然也算被污染了！），而且可能污染物是可以运动的。

• 损伤细胞。感染会杀死细胞，可能导致每个细胞都裂解和／或细胞层从附着物上剥离，更可能的是细胞变得不规则（或大或小），在低倍镜下是黑色的粒状

悬浮培养细胞比贴壁培养细胞更加难以显微观察，尤其是高倍显微镜下。

• 将培养瓶或培养皿放在显微镜的载物台上，静置一会。
• 将焦距对准器皿的底部，观察那些轻微附着的细胞，因为它们可能已经接触到了微生物。
• 对准整个培养瓶焦距，当发现细胞的时候，用细聚焦调节旋钮调节，仔细检查周围的培养基有没有污染发生。

如果你不能确定是否发生了污染

• 制作湿涂片或染色片。取1 ml 培养基离心，用50 μl 培养基或缓冲液重新悬浮细胞，滴一滴到载玻片，盖上盖玻片制成湿涂片；或涂片、固定并染色（甲基兰或革兰氏染液），在高倍镜下观察。
• 将细胞在营养培养基或琼脂培养基上划线， 37℃培养3 天。如果有菌落，那么细胞被污染了。
• 取1 ml 的细胞培养液至无菌的微量离心管中， 37℃培养3 天。观察到浑浊物，做湿涂片显微镜观察。

Mynox®杀除支原体功能强大有效，但价格较贵。

方法三：对于已耗费很多时间，大量扩增起来的细胞，或经过基因转染、体外刺激等大量工作处理过的细胞，如果发现细胞被支原体污染了，怎么办？此时由于期工作量巨大，使操作人员无法丢弃已有细胞。

但由于价格原因，又无法使用方法二提到的昂贵试剂杀除细胞上的支原体，

同时，实验人员还需要清除细胞上的支原体污染，让实验得以往下推进，以终获得准确的实验数据。

此时，实验者可选用对支原体的抑制剂，通过对细胞的期处理，中期加药，逐步通过4代左右的培养，得以将支原体污染清除，确保试验顺利推进，结果准确。

全此类试剂众多，笔者周围的实验人做过很多尝试，其中效果确切且性价比较高的当属德国Minerva公司的ZellShield®祛除剂。

它的原理是：通过抑制支原体增殖中DNA和蛋白的合成，达到抑制新的支原体增殖的目的。属复合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®时，不需使用链青霉素。

操作步骤：

第1步：研究发现，98%的支原体污染发生在细胞间隙。因此，先要把细胞消化下来，放入离心管，悬浮冲洗，离心，弃上清，反复三次。此时可将细胞上大部分的支原体去除，为进一步加药抑制做好准备。

第2步：培养液中加入1%的ZellShield®，细胞进行正常培养。新的支原体增殖受到抑制，旧的支原体随着细胞的换液逐步减少，通过4代左右的培养，细胞中的支原体基本可被清除。