脂肪酸β氧化速率比色法检测试剂盒产品说明书

主要用途

脂肪酸β氧化速率（β oxidation rate）比色法检测试剂是一种旨在通过棕榈酰肉碱氧化依赖性铁还原，即单位时间还原产物的峰值降低，即采用比色法来测定线粒体裂解样品中脂肪酸β氧化速率的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞、组织中线粒体裂解悬液样品（动物、人体等）脂肪酸β氧化速率的检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段，是体内，尤其是组织器官，例如肝脏、心脏和骨骼肌等能量内平衡的关键代谢通路。食物中甘油三酯提供体内三分之一的能量供给，骨骼肌和心脏消耗80%的总能量。脂肪酸代谢异常，将导致脂质聚集在非脂肪组织内，产生慢性病的病理基础，例如糖尿病、心衰、肥胖症等。其中β氧化，包括脱氢、水合、二次脱氢和硫解，是将活化的各种长度脂酰辅酶酯（acyl CoA esters）不断缩短为乙酰辅酶A（acetyl CoA）单位，最后经过三羧酸循环和呼吸链氧化成CO2和水。脂酰基辅酶A脱氢酶（acyl CoA dehydrogenase；AD；EC.1.3.99.3）是脂肪酸代谢进入β-氧化后工作的重要酶之一。通过底物棕榈酰肉碱（palmitoyl carnitine）的氧化产生的电子，由铁（ferricyanide）捕获而还原，其还原速率的检测，来评价β氧化的速率，即吸光值（420nm波长）的下降与时间的对应关系。

产品内容

缓冲液（Reagent A）  20毫升

反应液（Reagent B）   2毫升

底物液A（Reagent C）  1毫升

底物液B（Reagent D）  1毫升

阴性液（Reagent E）   1毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存反应液（Reagent B）、底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于反应操作的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如纯化线粒体），至于冰槽里备用

2． 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长420nm和470nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零 

3． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照

4． 缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

二、 背景对照测定

1． 移取750微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升反应液（Reagent B）

3． 加入50微升底物液A（Reagent C）

4． 加入50微升底物液B（Reagent D）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在25℃温度下孵育3分钟

7． 加入50微升阴性液（Reagent E）

8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照【（OD420—OD470）0分钟－（OD420—OD470）5分钟】

三、 样品测定

1． 移取750微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升反应液（Reagent B）

3． 加入50微升底物液A（Reagent C）

4． 加入50微升底物液B（Reagent D）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在25℃温度下孵育3分钟

7． 加入50微升待测样品（500微克线粒体蛋白）（注意：样品须清澈）

8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数【（OD420—OD470）0分钟－（OD420—OD470）5分钟】 

四、计算氧化速率

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.5（样品质量；毫克）X 105（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝微摩尔铁还原/分钟/毫克

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要 

5． 加样后3秒内比色测定

6． 测定值由高到低变化；测定可持续5分钟

7． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

8． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有氧化功能

9． 建议待测样本线粒体蛋白浓度为500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感