纯化线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

黑色96孔板：用于线粒体荧光分析的容器

1.5毫升离心管：用于线粒体染色的容器

载波片/盖玻片：用于线粒体样品存放后荧光分析

微型台式离心机：用于沉淀线粒体

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于线粒体荧光分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于线粒体荧光定量分析

实验步骤

一、 直接法

1． 准备好待测的纯化线粒体样品

2． 移取100微升线粒体样品（总量为0.2毫克）到1.5毫升离心管

3． 加入xx微升染色液（Reagent A），混匀

4． 放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟，避免光照

5． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

6． 小心抽去上清液

7． 加入xx微升37℃预热的保存液（Reagent C），混匀颗粒群

8． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

9． 小心抽去保存液（Reagent C）

10． 小心加入xx微升37℃预热的保存液（Reagent C），混匀颗粒群

11． 选择下列方式之一进行操作：

（A）使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述悬液到载波片上，盖上盖玻片 

2）激发波长488nm，散发波长505nm――

绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

（B） 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1）移取100微升上述悬液到100微升比色杯或黑色96孔板

2）即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长488nm，散发波长505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

二、 间接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，中和液（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升中和液（Reagent B），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

1． 准备好待测的纯化线粒体样品

2． 移取100微升线粒体样品（总量为0.2毫克）到1.5毫升离心管

3． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心抽去上清液

5． 加入xx微升含有染色液（Reagent A）和中和液（Reagent B）的染色工作液，充分混匀 

6． 放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟，避免光照

7． 选择下列方式之一进行操作：

a) 使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）

2）激发波长488nm，散发波长505nm――绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

b) 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1） 移取100微升上述悬液到100微升比色杯或黑色96孔板

2） 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）：激发波长488nm，散发波长505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 染色前，所有试剂溶液，除染色液（Reagent A）外，需37℃预热

4． 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析 

5． 孵育时，必须避免光照

6． 本产品友好使用于双重染色或重叠染色

7． 如果不具备505nm散发波长的滤波器，可以使用505nm至530nm中的任一波长

8． 如果黑色96孔板的背景读数过高，可以选择530nm散发波长

9． 如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则荧光缓慢且自发降低

10． 本公司提供膜通道孔抑制剂：D 0.2毫摩尔环胞素A（cyclosporine A）－12226，维护荧光完整

11． 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

本产品经鉴定荧光清晰