真菌/酵母细胞线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂盒产品说明书

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，将染色工作液置入暗室里。同时开启荧光显微镜或荧光光度仪。然后进行下列操作。

一、 活体染色

1． 准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107细胞/毫升）

2． 移入到1.5毫升离心管

3． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心抽掉上清液

5． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

6． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

7． 小心抽掉上清液

8． 重复实验步骤5至7一次

9． 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混匀（注意：参见注意事项6）

10． 放进20℃培养箱里孵育20分钟

11． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心抽掉上清液

13． 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

14． 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心抽掉上清液

16． 加入xx微升预冷的清理液（Reagent A），混匀

17． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察（定性检测）：

1） 移出5微升在载玻片上，放上盖玻片

2） 即刻进行载玻片压片（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm

红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

（B）激发波长495nm，散发波长519nm

绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

18． 或使用荧光分光光度仪

1） 移取500微升染色后的细胞样品到用户自备的1毫升比色皿

2） 加入xx微升清理液（Reagent A）

3） 上下倾倒混匀

4） 即刻放进荧光分光光度仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低