本试剂盒仅供科研使用
腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase, ADA)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS8340F 分光法 48 样)
一、产品简介:
腺苷脱氨酶(ADA,EC 3.5.4.4)是一种琉基酶,是嘌呤核苷酸代谢的关键酶,与机体
细胞的免疫活性有重要关系。
腺苷脱氨酶(ADA)催化腺嘌呤核苷水解,产生次黄嘌呤核苷和氨,利用氨在强碱的
环境下与次氯酸盐和苯酚作用,生成水溶性染料靛酚蓝,溶液颜色稳定。其在 630nm 处
有特征吸收峰,通过检测氨增加的速率,即可计算该酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×2 瓶
4℃保存
临用甩几下使粉体落入底部,每瓶再加
11mL 蒸馏水溶解备用。
试剂三
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体 24mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
液体 12mL×1 瓶
4℃保存
试剂六
A:液体 7mL×4 瓶
B:液体μL×1 支
4℃保存
临用取 60μL 的 B 液进一瓶 A 液中,混
匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六一
周内用完。
标准管
液体 mL×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该标曲。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液枪、研钵、
冰和蒸馏水。
四、腺苷脱氨酶(ADA)活性测定:
1、样本制备:
① 组织样本:称取约 0.1g 组织(水分足的样本可取 0.2-0.5g),加入 1mL 提取液;进行
冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:也可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 630nm,蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
80
80
试剂一
200
200
试剂二
200
试剂三
200
混匀,放入 37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 30min
试剂二
200
试剂三
200
混匀,室温 12000rpm 离心 10min,上清液待测。
③ 显色反应:在 EP 管中依次加入:本试剂盒仅供科研使用
2
试剂名称(μL)
测定管
对照管
上清液(上步反应)
60
60
蒸馏水
180
180
试剂四
240
240
试剂五
120
120
试剂六
240
240
充分混匀,37℃放置 20min 后,全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿(光
径 1cm)中,于 630nm 处读取吸光值 A,
ΔA=A 测定管-A 对照管(每个样本做一个自身对照)。
【注】1. 试剂四和五和六需分开加,不能事先混匀。
2. 若ΔA 的值较小,可增加 37℃孵育时间(如增至 1 小时或更长),或在显色阶段增加上清液量
V1(如增至 120μL,则蒸馏水体积相应减少);则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3. 若 A 测定大于 1.8,可减少 37℃孵育时间(如减至 10min 或更短),或在显色阶段减少上清液
量 V1(如减至 30μL,则蒸馏水体积相应增加);则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程为 y =23.259x - 0.0071;x 为标准品摩尔质量(μmoL),y 为吸光值ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每毫克蛋白质每小时催化腺苷生成 1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ADA (μmoL/h/mg prot)=(ΔA+0.0071)÷23.259×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T
=12.2×(ΔA+0.0071)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
单位定义:每克组织每小时催化腺苷生成 1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ADA (μmoL/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0071)÷23.259×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T
=12.2×(ΔA+0.0071)÷W
4、按照液体体积计算:
单位定义:每毫升液体每小时催化腺苷生成 1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ADA (μmoL/h/mL)=(ΔA+0.0071)÷23.259×(V2÷V3)÷V1÷T=12.2×(ΔA+0.0071)
V---提取液体积,1mL;
V1----加入②歩反应体系中样本体积,0.08mL;
V2---②歩反应体系总体积:0.68mL;
V3---③歩显色步骤中上清液体积,0.06mL;
T---反应时间,0.5h;
W---样本质量;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 标准品母液(10μg/mL 的氨(分子量是 18)),把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度
的标准品:0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。