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柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序)
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品牌名称：$brandModel.Title型号： 原产地：中国大陆 更新时间：2026/10/15 9:32:24
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详细内容
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和进化研究都需要纯化线粒体DNA。本产品先纯化动物细胞线粒体、再从中纯化其DNA。
| 产品名称 | 英文名称 | 规格 |
| 柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序) | Animal mitochondrial DNA column extraction kit(Sequencing Grade) | 15次 |
产品特点：
即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，基因组DNA污染少。
本产品可以用15次，一次可以处理约1×108个培养细胞（相当于5瓶150mm培养细胞），可以纯化到到0.2～0.5mg线粒体。
适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。
提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。
运输及保存：
常温运输和保存，保存期限一年。其中有3个成分（见上表）放低温成分袋，低温运输，-20℃保存。
自备试剂：
PBS缓冲液、、0.5M EDTA溶液（pH8.0）。
人TPMT VNTR的上游引物为5 GCT CCG CCC TGC CCA TTT 3，
人TPMT VNTR的下游引物为5 GCC TCC GCC ACC AAT GAC 3，
人线粒体HV2区的上游引物为5 GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C3，
人线粒体HV2区的下游引物为5 CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A3。
使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，溶液和离心管都需预冷。
一、准备工作
未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用需溶解沉淀并摇匀。
将50mL溶液A和250mL溶液B放冰上预冷待用。
配制1.0M低比重溶液100mL:将34克蔗糖用100mL溶液B溶解并放冰上待用。
配制线粒体重悬液100mL:将75mL溶液B和25mL1.0M低比重溶液混合，冰上待用。
二、线粒体粗提
如果提取材料是单层培养细胞，先用20mL自备的PBS缓冲液洗涤1×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集1×108个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000g 4℃离心10分钟，弃上清留沉淀。
加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。
冰上放置4～5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。
如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20～30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10～15mL，间隙为0.12mm，好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其适匀浆次数不同，一般需要40次～60次左右。匀浆是线粒体纯化关键的步骤，故匀浆好先通过预实验确定适匀浆次数，方法是每匀浆5～10次后，取2～3μL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
加入1/3体积的、预冷的1.0M低比重溶液，轻柔混匀。
用平甩转子离心机4℃1000g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃15000g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
用5mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃15000g离心15分钟，弃上清。
重复上步一次。
如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第4部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。
三、细胞核DNA的去除及鉴定
将线粒体重悬于0.3mL预冷的线粒体重悬液中，取10μL作为未处理线粒体（后面将使用）。
加入6μL Benzonase（1U/uL）溶液和30μL DNase A溶液（配法：将0.5mL 10×DNase A反应液加到装有5mg DNase A干粉的离心管中得到10mg/mL DNase A溶液，未用完的此溶液需要分装后放-20℃保存）。
37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：好先预实验，每隔一段时间取10μL样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增人基因组TPMT VNTR位点和人mtDNA HV2区(两基因的PCR引物见自备试剂)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为佳。相关引物和PCR试剂需要自备。可用未处理线粒体做对照。
加入10μL自备的0.5M EDTA溶液（pH8.0）以终止酶反应。詹纳斯绿B染色并在显微镜下检查线粒体完整性（操作见上）。
4℃10000g离心10分钟，弃上清。
用1mL的预冷线粒体重悬液重悬线粒体后，4℃10000g离心10分钟，弃上清留沉淀。
重复上步操作，后得到无基因组DNA污染的线粒体沉淀。
四、线粒体DNA提取
在线粒体沉淀中加入600μL预热的细胞器DNA纯化溶液A到线粒体沉淀中，充分吹打均匀。
再加入300μL预热的细胞器DNA纯化溶液B到离心管中（此溶液粘稠，需要预热到65℃取用），颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
65℃放置5分钟。
加入200μL自备，震荡混匀10～30，此时溶液将呈乳白色。
12000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
加入1.5倍体积的细胞器DNA纯化溶液C，颠倒混匀后转移到离心吸附柱中，静置2分钟。
12000g室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，12000g室温离心1分钟，弃穿透液。
重复上步操作一次。
空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
加30～50μL DNA洗脱液2.0，室温放置3～5分钟。
12000g室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液，立即使用或放-20℃长期保存。
人脂联素(ADP/Acrp30)酶联免疫吸附测定试剂盒 别称:GBP28, ACDC, APM1, ADPN, AdipoQ, ADIPQTL1 Human ADP/Acrp30(Adiponectin) ELISA Kit 用途 该试剂盒用于体外定量检测Human 血清，血浆或其他生物体液中天然及部分重组ADP/Acrp30浓度
人补体成分5a(C5a)酶联免疫吸附测定试剂盒 别称:C5a Human C5a(Complement Component 5a) ELISA Kit 用途 该试剂盒用于体外定量检测Human 血清，血浆或其他生物体液中天然及部分重组C5a浓度
人Bcl-2相关X蛋白(BAX)酶联免疫吸附测定试剂盒 别称:BCL2L4 Human BAX(Bcl-2 Associated X Protein) ELISA Kit 用途 该试剂盒用于体外定量检测Human 血清，血浆或其他生物体液中天然及部分重组BAX浓度
Stauntosaponin A 1417887-91-2 中文名： 分子式：C28H38O7 度：97.0% 关键词： 小鼠(NO)ELISAKit
Stanozolol 10418-03-8 中文名：康力龙 分子式：C21H32N2O 度：98.0% 关键词： 小鼠β酚(β-Nph)ELISAKit
Stanolone 521-18-6 中文名：雄诺龙 分子式：C19H30O2 度：98.0% 关键词： 小鼠补体蛋白3(C3)ELISAKit
Sprengerinin C 88861-91-0 中文名： 分子式：C44H70O16 度：98.0% 关键词： 抗肿瘤; 麦冬; 螺甾烷; 甾苷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库 小鼠叠氮胸苷(AZT)ELISAKit
Sprengerinin A 88866-99-3 中文名： 分子式：C38H60O12 度：% 关键词： 麦冬; 螺甾烷; 甾苷; 植物提取物; 天然产物; 天然产物库 小鼠氧化型谷胱甘肽elisa试剂盒 小鼠氧化型谷胱甘肽试剂盒 规格型号：96T/48T 小鼠氧化型谷胱甘肽试剂盒，规格型号：96T/48T，来源：elisa试剂盒（进口分装），产品别名：小鼠氧化型谷胱甘肽试剂盒、小鼠氧化型谷胱甘肽elisa试剂盒 保存条件：2-8℃ 保质期：6个月。
柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序)Glaucogenin C mono-D-thevetoside 849201-84-9 中文名： 分子式：C28H40O9 兔子抗中性粒细胞颗粒抗体(ANGA)ELISA 试剂盒 96T/48T 试剂盒 组装/原装
17α-Estradiol 57-91-0 中文名：17α-雌二醇 分子式：C18H24O2 Human signal ansduction molecule (Smad1) ELISA Kit 人信号转导分子(Smad1)ELISA试剂盒
Stauntosaponin A 1417887-91-2 中文名： 分子式：C28H38O7 Humanai-Qfeveraibody,ai-Q-AbELISAKit 人抗Q热抗体(ai-Q-Ab)ELISA试剂盒 96T/48T 进口分装
Ergosta⁻⁷,22-dien-3-one 32507⁻⁷7-0 中文名：麦角甾⁻⁷,22-二烯-3-酮 分子式：C28H44O HumanEndomeiumAibody,EMAbELISA试剂盒人抗内膜抗体(EMAb)ELISA试剂盒规格：96T/48T
Estradiol 50-28-2 中文名：雌二醇 分子式：C18H24O2 组织PKA激酶活性定量检测试剂盒(A/B/C)20次
操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
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