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Rosetta-gami 2(DE3)化学感受态细胞
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详细内容
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
产品属性:
中文名称:Rosetta-gami 2(DE3)化学感受态细胞
英文名称:Rosetta-gami 2(DE3)Chemically Competent Cell
产品规格:10×100μl|50×100μl
产品货号:GOY-F10997
| Rosetta-gami 2(DE3)菌株集合了Rosetta 2和Origami 2两种菌株的优点: pRARE2赋予其Rosetta2菌株的优点——补充缺乏的7种稀有密码子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA和CGG)对应的tRNA,提高外源基因的表达水平。 gor522::Tn10 trxB赋予其Origami2菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)(trxB)和还原酶(glutathione reductase)(gor)基因,它们是还原途径的两个关键酶,其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白,增蛋白的可溶性;同时该菌株不具有卡那抗性,可用于具有卡那抗性质粒的蛋白表达。 该菌株染色体整合了λDE3区(DE3区含有T7RNA聚合酶)适合 T7启动子诱导的蛋白表达。 Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有氯,链,四环素抗性,由特殊工艺制作,经pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。 保存条件:-80℃ 基因型: D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL(DE3)F’[lac+lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2(CamR,StrR,TetR) 操作说明: 1.Rosetta-gami 2(DE3)菌株感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25分钟。 2.42℃水浴热激45,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。 3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60分钟。 4.5000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。 注意事项: 1.感受态细胞好在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。 2.混入质粒时应轻柔操作。 3.转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。 4.诱导时,IPTG浓度可选(0.1-2 mM均可)。 5.为获得需要量的蛋白,佳诱导时间,温度,IPTG浓度需实验者优化。 |
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
细胞αSMA蛋白表达比色法定量检测试剂盒10/50 次猪α干扰素(IFN-α)ELISA试剂盒,
Rosetta-gami 2(DE3)化学感受态细胞铵盐:≤0.1%
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