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NMY51酵母感受态细胞
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详细内容
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
产品属性:
中文名称:NMY51酵母感受态细胞
英文名称:NMY51 Chemically Competent Cell
产品规格:10×100μl|50×100μl
产品货号:GOY-F10977
| DUALmembrane系统是门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术,它利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用,是目市面上检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。 此系统采用NMY51酵母菌株,可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验;此菌株Transformation marker为:trp1,leu2-3,报告基因为:HIS3,ADE2和lacZ,第yi步通过营养缺陷型报告基因(HIS3,ADE2)进行选择性生长筛选,进一步通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选,三个独立的报告基因,受不同启动子的调控,降低假阳性几率。 原理:泛素(ubiquitin)分子量很小,由76aa 残基组成;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的N端,然后被泛素一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。 泛素可以人为分成两部分:N端(Nub),C端(Cub)。先,人为地将泛素Nub的3位异亮突变为甘(NubI突变为NubG)。这样与Cub的亲合力大大降低,避免了Cub和Nub自我结合或接近的可能性。其次,将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。 正常条件下NubG不与Cub结合,UBPs也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成bait融合蛋(bait-cub-LexA-VP16)和prey融合蛋白(prey-NubG)。 如果bait和prey发生相互作用,就会促使NubG和Cub的相互接近,被 UBPs识别,导致LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。 注意事项: 1.感受态细胞好在冰上融化。 2.转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。 3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。 4.NMY51酵母菌株对高温敏感,适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。 5.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60h培养可见直径1mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80h培养可见直径1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培养可见直径1mm克隆。 |
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
果蝇细胞磺脂突变诱导试剂盒10次小鼠白介素1β (IL-1β)ELISA试剂盒,
NMY51酵母感受态细胞英文名称:MSG hydrate;L-Glutamate sodium hydrate;Sodium L-glutamate hydrate;L-Glutamic acid monosodium salt hydrate
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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