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Stbl3化学感受态细胞
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详细内容
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
产品属性:
中文名称:Stbl3化学感受态细胞
英文名称:Stbl3 Chemically Competent Cell
产品规格:10×100μl|50×100μl
产品货号:GOY-F10911
| Stbl3菌株来源于HB101 E.coli strain,是慢病毒载体系统推荐使用的菌株。 基因组含有重组酶recA13突变,可有效抑制长片段末端重复区的重组,降低错误重组的概率;但不含核酸酶endA1突变,体内核酸酶含量较高,提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液。 此菌株具有链抗性,不存在lacIqZΔM15,不可用于蓝、白斑筛选。Stbl3感受态细胞经特殊工艺制作,经pUC19检测转化效率>108cfu/μg DNA。 保存条件:-80℃ 基因型: F-mcrB mrr hsdS20(rB-,mB-)recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR)xyl-5λ-leu mtl-1 endA1+ 操作说明: 1.Stbl3感受态细胞放置冰中融化(或放手心或室温片刻,待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中),加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,冰上静置25分钟。 2.42℃水浴热激45,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。 3.向离心管中加入0.9 mL室温S.O.C.培养基,使用其他培养基会降低转化效率。 4.30℃,225 rpm复苏90分钟。(当质粒中含有不稳定片段时,30℃培养可降低错误重组的概率,若转化control PUC19计算转化效率,则需37℃,225 rpm复苏60分钟。) 5.5000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的S.O.C.培养基上。 6.将平板倒置放于30℃培养箱过夜培养。(若转化control PUC19计算转化效率,则需37℃培养过夜) 注意事项: 1.感受态细胞好在冰上融化。 2.混入质粒或连接产物时应轻柔操作。 3.转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少终用于涂板的菌量。 |
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
1,3-环己二酮(>98.0%(GC)(T))金龙胆草提取物动物组织总ATP酶(total ATPase)活性比色法定量检测试剂盒
Stbl3化学感受态细胞保存:RT
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