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LP2000转染试剂
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详细内容
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
产品属性:
中文名称:LP2000转染试剂
英文名称:LP2000 Transfection Reagent
产品规格:0.5ml|1.5ml|5×1.5ml
产品货号:GOY-F10781
| 本转染试剂是一种非常高效的新型转染试剂,达到了国际主流转染试剂的转染效果。适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中,也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。对于六孔板,一个包装的本转染试剂大约可以转染100个孔;对于24孔板,一个包装的本转染试剂大约可以转染500个孔。 LP2000转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性,并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。 LP2000转染试剂的使用方法和常用的Lipofectamine 2000 Reagent完全一致。并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试,转染效率也和Lipofectamine 2000 Reagent相当甚至略高。 LP2000转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染,也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。 LP2000转染试剂转染过表达质粒后,通常24~48小时后达到较高的蛋白表达水平,并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时;转染siRNA通常3~5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。 LP2000转染试剂转染细胞时,基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响,即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。但为了取得佳的转染效果,推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。 LP2000转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。 注意事项: 使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。对于质粒,可以使用的质粒大量抽提试剂盒(YT003)进行抽提,以保证可以获得较高的转染效率。 转染细胞必须处于良好的生长状态。 需自备不含抗生素的无血清培养液或Opti-MEM培养液或普通的DMEM培养液。 LP2000转染试剂不能vortex或离心,宜缓慢晃动混匀。 LP2000转染试剂使用后请立即盖好盖子,避免长时间暴露在空气中,影响转染效率。 保存条件: 4℃保存。长期不使用可以-20℃保存。 |
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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