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荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)
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详细内容
低温非冻型保存,不破坏病毒的外壳,方便长途运输。
适用于各种拭子样品,包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子等。
可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。
可以用柱式病毒DNA提取试剂盒或柱式病毒RNA提取试剂盒提取病毒核酸。
试剂本身安全环保无毒。
储存条件:常温,有效期一年。
下列是产品的订购信息!
| 中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 货号 |
| 荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I) | 2×ByFast SYBR Green qPCR Mix | 1mL|5×1mL|25×1mL | GOY-F10693 |
产品说明书:
| 本制品是一种用于实时荧光定量PCR,即qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品质预混液,主要用于cDNA和基因组DNA等的特异性高灵敏度定量检测。 本制品使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA(dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱,一旦与双链DNA结合后,其荧光会大大增。这样通过检测荧光弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。 本制品使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶,能够实现便捷高效的热启动。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合,从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性,这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活,这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来,预变性之不会发生DNA聚合反应,从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。 本制品包含了ByFast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分,使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、样品DNA和去离子水即可。 保存:-20℃避光保存,一年有效;4℃避光保存,一个月内有效。尽量避免反复冻融。 规格说明: 本制品如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20μL),每mL本产品可以进行100次检测;如果用于常规的384孔板qPCR检测(建议反应体系为10μL),每mL本产品可以进行200次检测。 注意事项: 使用需确保整管试剂完全融化,上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。 注意引物退火温度,当退火温度<60℃时,推荐使用三步法PCR扩增。 本制品中含有SYBR Green I荧光染料,保存本产品或设置PCR反应时应避免光照射,以尽量避免荧光淬灭问题。 对于过350bp或者高GC含量的扩增片段,建议增加延伸时间至60或者采用三步法以提高扩增效率。 经测试,本制品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品,反复冻融可能使产品性能下降。 qPCR检测是高灵敏度的检测,PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃,以避免高浓度的PCR产物污染实验环境。 |
注意:标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子好在发病的3天采集。
在安全柜内将本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5mL旋盖塑料管里(一容器)。
鼻拭子的采集:将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
咽拭子的采集:用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将棉签浸入步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
直接在一容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封;每袋装一份标本。同时也将标本有关信息填在标本送检表上,连同一容器封于塑料袋内。
将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器(二容器)内,拧紧盖,在容器上标明有关信息。同一患者2份以上的密封标本,可以放在同一个二容器内。二容器要承受不少于95 KPa的压力,内衬具吸水和缓冲能力的物质。所有容器必须印有生物危险标注。
将二容器摆放在用运输箱内(或疫苗运输箱),放入冰排,然后以柔软物质填充,并密封,由人(2人)运送,不得邮寄,好使用车。
采集的标本若不能在24小时内送达,则应尽快在⁻⁷0℃以下保存。无⁻⁷0℃条件的,需在4℃冰箱短时间暂存,并尽快联系递送标本。流感病毒在-20℃~-40℃时不稳定,故长期保存好在⁻⁷0℃温度以下进行。
操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
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