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HRM分析试剂盒(染料法)
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详细内容
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
产品属性:
中文名称:HRM分析试剂盒(染料法)
英文名称:HRM Analysis Kit (EvaGreen)
产品规格:20μl×125次|20μl×500次
产品货号:GOY-F10562
| 本试剂盒结合了饱和染料EvaGreen和抗体酶的优点,是一款适用于高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析的业试剂盒。本品是一种2× PreMix,PCR反应液配制十分简单方便;具有分辨率高和模板高度适应性等特点。与SYBR Green不同,EvaGreen在高浓度情况下不会抑制PCR反应;可以使双链PCR产物的结合量达到饱和状态,所以称为“饱和染料”。不会产生SYBR Green的“染料重排”现象,能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。本产品可用于已知SNP分析,未知SNP筛选,以及未知突变基因扫描和甲基化PCR分析等研究。 产品特点: ·高分辨率:采用EvaGreen饱和染料,在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率,可以区分单个碱基的变异。 ·高特异性:采用抗体修饰的热启动DNA聚合酶,降低非特异性扩增,提高特异性。 ·高稳定性:精心优化Buffer体系,增加了熔解曲线的稳定性,提高结果可信度。 · ROX校正:单独包装的ROX染料,使用更灵活,结果更准确。 试剂盒原理: SYBR Green是目被广泛应用于荧光定量PCR分析的荧光染料,但由于对PCR的抑制较严重,会被控制在较低的使用浓度,SYBR Green与双链DNA的结合处于非饱和状态,所以称为“非饱和染料”。SYBR Green的这种性质会导致在“染料重排”现象的发生,从而影响熔解曲线的分辨率,所以不能够通过熔解曲线区分扩增产物之间单个碱基之间的差异。 EvaGreen是一种同时适用于荧光定量PCR和HRM分析的新一代染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制,选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用,同时也允许在染料饱和浓度下进行分辨单碱基差异的HRM分析。 |
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
动物硬组织可溶性膜(粗提)制备试剂盒20次BPLS琼脂鸭子碳酐(CA)ELISA试剂盒,
HRM分析试剂盒(染料法)Fern⁻⁷-en-19-one
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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