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Real-Time PCR预混反应液(染料法)
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详细内容
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
产品属性:
中文名称:Real-Time PCR预混反应液(染料法)
英文名称:SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)
产品规格:125次|500次|5000次
产品货号:GOY-F10513
| 本制品是Real-Time PCR用试剂,使用简单方便,独特双组分热启动DNA聚合酶,添加独特H-Bond因子的Buffer体系和单独包装的ROX等优点外,因对Buffer精心调整,可更有效地减少引物二聚体和非特异性扩增的产生,使其具有更高的扩增特异性和广泛模板适应性的特点。 本试剂盒采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶进行PCR扩增,通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光度,达到检测PCR产物扩增量的目的。 本试剂盒中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统。酶活自动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占绝大部分比例,其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃高温的一个缓释过程,而Anti Taq DNA聚合酶则在95℃高温下完全激活。经过95℃条件下孵育15min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶,进入PCR循环后,每经过一轮95℃条件下变性,即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。PCR反应初期,完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到佳酶活状态,而在整个PCR反应过程中,每一轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此,SuperReal PreMix Plus在整个PCR反应过程始终保持佳的DNA聚合酶活力,配合精心优化Buffer体系,从而可以获得高扩增效率,高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性。 产品特点: · SuperReal PreMix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶),从而构成酶活自动调节系统,配合精心优化buffer体系,具有高扩增效率,高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。 ·本产品Buffer体系平衡了K+和NH4+的比例,还特别添加了独特的H-Bond因子,能协同调整反应体系中的氢键作用力,使引物模板退火条件更加严谨,反应的一性增,重复性更好。 · SuperReal PreMix Plus中预混有SYBR Green I,PCR反应液配制时,只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应,操作简单方便。 ·本产品附带ROX Reference Dye,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。 |
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
冰冻切片组织线粒体复合物IV表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20次发动2(DNM2)重组大鼠主要组织相容性复合体Ⅰ类(MHCⅠ/AgBⅠ/H-1Ⅰ)ELISA试剂盒,
Real-Time PCR预混反应液(染料法)Syringaldehyde
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