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Pfu DNA 聚合酶
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详细内容
| 本公司生产的Pfu DNA Ploymerase是从克隆有Pyrococcusfuriosis DNA Ploymerase基因的中表达并经过柱纯化分离出来的重组蛋白,其分子量为90kDa。由于Pfu酶具有3’→5’核酸外切酶活性,它能纠正DNA扩增过程中产生的错配,而传统的Taq酶却不能,其它耐热DNA Polymerase如Vent、Deep Vent、Tli、UITma等虽具有校正功能,但Pfu酶是目已发现的所有耐热DNA Polymerase中出错率低的。Pfu酶无5’→3’核酸外切酶活性,PCR反应中的延伸速度一般为0.5-1kb/分钟,比Taq酶要低。Pfu 酶比Taq酶热稳定性更好,95℃ 1小时仍保持90%以上的活性,对于GC含量很高的模板,变性温度可以提高到98℃而不影响其活性。Pfu酶的PCR产物为平末端,可加A处理再与T-载体连接或使用平末端克隆载体。一般用于DNA的高保真扩增,如基因表达克隆、基因定点突变、细胞内基因点突变分析(SNP)和末端补平等。。 Pfu来源:表达Pfu DNA聚合酶的。 Pfu酶储存缓冲液:50mMTris-HCl,pH 8.2;0.1mM EDTA;1mM DTT;0.1% Nonidet P40;0.1% Tween 20;50% 甘油。 Pfu单位定义:在74℃条件下,30分钟内催化10 nmmoldNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需要的酶量为一个单位。 Pfu用途:1)常规PCR反应中的DNA高保真体外扩增; 2)基因定点突变和拼接。 Pfu注意事项: 1、 酶浓度:建议在50ml的体系中使用1.25个单位的Pfu DNA聚合酶,因为酶存在3’-5’外切酶活性,高浓度的酶可能会增加降解引物的可能性。好在加完dNTP后再添加Pfu DNA聚合酶。并在有冰浴的条件下混合PCR反应中的各种成分。 2、延伸时间:Pfu DNA聚合酶的延伸速率低于Taq DNA聚合酶,大约为一分钟600个碱基(Taq DNA聚合酶大约为一分钟2000个碱基),因此建议扩增1Kb的DNA用两分钟的延伸时间。对于大多数的反应而言,25~35个扩增循环就足够了。 Pfu保存:-20℃保存至少一年。 别名:Pfu DNA 聚合酶 英文名称:Pfu DNA Polymerase 储存条件:-20 性状:液体 |
| 中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 货号 |
| Pfu DNA 聚合酶 | Pfu DNA Polymerase | 500U|1000U|10KU | GOY-F10472 |
使用方法:
注意:标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子好在发病的3天采集。
在安全柜内将本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5mL旋盖塑料管里(一容器)。
鼻拭子的采集:将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
咽拭子的采集:用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将棉签浸入步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
直接在一容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封;每袋装一份标本。同时也将标本有关信息填在标本送检表上,连同一容器封于塑料袋内。
将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器(二容器)内,拧紧盖,在容器上标明有关信息。同一患者2份以上的密封标本,可以放在同一个二容器内。二容器要承受不少于95 KPa的压力,内衬具吸水和缓冲能力的物质。所有容器必须印有生物危险标注。
将二容器摆放在用运输箱内(或疫苗运输箱),放入冰排,然后以柔软物质填充,并密封,由人(2人)运送,不得邮寄,好使用车。
采集的标本若不能在24小时内送达,则应尽快在⁻⁷0℃以下保存。无⁻⁷0℃条件的,需在4℃冰箱短时间暂存,并尽快联系递送标本。流感病毒在-20℃~-40℃时不稳定,故长期保存好在⁻⁷0℃温度以下进行。
操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
产品特点:
低温非冻型保存,不破坏病毒的外壳,方便长途运输。
适用于各种拭子样品,包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子等。
可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。
可以用柱式病毒DNA提取试剂盒或柱式病毒RNA提取试剂盒提取病毒核酸。
试剂本身安全环保无毒。
储存条件:常温,有效期一年。
PAR-2表达elisa试剂盒25次人支气管平滑肌裂解物人新生儿促状(N-TSH)ELISA试剂盒,
Pfu DNA 聚合酶4-(2-Hydroxy-1-methoxyethyl)-1,2-benzenediol
热门标签:Pfu,DNA,聚合酶













